Plan de plaque, validation de méthode...

[invite87d28b5f]

Bonjour à tous,

Alors voilà, j'ai une petite question à vous poser. Dans le cadre de la validation d'une méthode de PCR, je dois mettre en place des plans de plaque de 96 puits avec comme références, un solution de plasmide , une lignée cellulaire et des échantillons cliniques. Tous positif au gène en question.

Le but est de mettre en évidence des degrés de variation de l'amplification de la méthode en fonction de ces isolats. En gros évaluer la sensibilité et spécificité de la méthode en fonction de paramètres comme répétibilité, la manip inter et intra-opérateur...

• Donc ma question est : auriez-vous des exemples concrets de plans, type mesurer une possible contamination avant l'amplification, en alternant puits positif, puit négatif sur la plaque, ainsi de suite et analyser la constance d'amplification ?

Pas trop évident comme question, mais si quelqu'un peut m'éclairer même qu'un tout petit peu. On vous remerciant.

Cordialement, Paullepoulpe.
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[Flyingbike]

Bonjour

Je vous réponds ici

Je ne suis pas sur de bien saisir la problématique.

S'il s'agit de mesurer l'efficacité de la PCR en fonction du type d'échantillon, j'imagine que vous avez prévu de faire des gammes de concentrations pour chaque. Il est bien intéressant de faire des triplicates (et non des duplicates) pour chaque point (ou par exemple pour un point concentré et un plus dilué) pour déterminer la variabilité intra-expérimentale, de même que plusieurs blancs, par exemple avant et après la manipulation des échantillons d'ADN comme vous avez l'air de le suggérer.

La différence entre ces blancs vous donnera probablement une idée de la contamination liée au dépôt des échantillons dans les puits.

En ce qui concerne l'efficacité de la PCR a proprement dit, je ne vois pas ou vous voulez en venir. Cette efficacité étant dépendante du milieu réactionnel, on pourrait s'attendre à une variation entre les types d'échantillon et c'est peut être cela que vous voulez estimer ? dans quel but ? Vous pourrez peut-être voir si la variabilité inter-échantillons est inférieure ou supérieure a la variation intra-expérimentale.

[invite87d28b5f]

En vous remerciant de votre réponse.

Oui exactement j'ai bien évidemment prévu de mettre en place des gammes de concentrations différentes comme référencée dans la littérature, triplicates aussi. Il y aurait-il d'autres exemples ?

En faite et j'espère que cela vous dira quelque chose, mais je dois mettre en place un "plan de plaque" en inspirant de guide (norme iso...) technique d'accréditation en biologie médicale. Avant optimisation du protocole.

En vous remerciant une nouvelle fois.

Respectueusement.

Bonjour

Je vous réponds ici

Je ne suis pas sur de bien saisir la problématique.

S'il s'agit de mesurer l'efficacité de la PCR en fonction du type d'échantillon, j'imagine que vous avez prévu de faire des gammes de concentrations pour chaque. Il est bien intéressant de faire des triplicates (et non des duplicates) pour chaque point (ou par exemple pour un point concentré et un plus dilué) pour déterminer la variabilité intra-expérimentale, de même que plusieurs blancs, par exemple avant et après la manipulation des échantillons d'ADN comme vous avez l'air de le suggérer.

La différence entre ces blancs vous donnera probablement une idée de la contamination liée au dépôt des échantillons dans les puits.

En ce qui concerne l'efficacité de la PCR a proprement dit, je ne vois pas ou vous voulez en venir. Cette efficacité étant dépendante du milieu réactionnel, on pourrait s'attendre à une variation entre les types d'échantillon et c'est peut être cela que vous voulez estimer ? dans quel but ? Vous pourrez peut-être voir si la variabilité inter-échantillons est inférieure ou supérieure a la variation intra-expérimentale.

[TanguyE]

Bonsoir,

Je rejoins un peu ce que dit Flyingbike.

L'idée étant, j'imagine, de préparer votre plan de plaque qui ne changera pas au cours de la validation de la méthode.

Donc en gros:
- un triplicate contrôle négatif: tout le mix réactionnel sauf l'ADN
- un triplicate blanc (que de l'H2O)
- une gamme étalon pour chaque type d'échantillon positif.

Ensuite il sera assez simple de calculer les efficacités d'amplification, de trouver les bonnes concentrations pour les amorces et la sonde, de déterminer la répétabilité et la reproductibilité.

Pour ce qui est des normes dont vous pourriez vous inspirer, je ne vois que celle-ci.

Cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite87d28b5f]

Messieurs,

Je vous remercie grandement de me confirmer ces informations. Pourrait-on également quantifier et comparer à un House Keeping gene et en faire un ratio avec l'amplification du gène cible ?

Ne pourrais-je pas m'appuyer sur les méthodes de quantification relative pour tout ce qui est spécificité ?

Respectueusement.

Bonsoir,

Je rejoins un peu ce que dit Flyingbike.

L'idée étant, j'imagine, de préparer votre plan de plaque qui ne changera pas au cours de la validation de la méthode.

Donc en gros:
- un triplicate contrôle négatif: tout le mix réactionnel sauf l'ADN
- un triplicate blanc (que de l'H2O)
- une gamme étalon pour chaque type d'échantillon positif.

Ensuite il sera assez simple de calculer les efficacités d'amplification, de trouver les bonnes concentrations pour les amorces et la sonde, de déterminer la répétabilité et la reproductibilité.

Pour ce qui est des normes dont vous pourriez vous inspirer, je ne vois que celle-ci.

Cordialement

[TanguyE]

Dans la mesure où vous avez une solution de plasmides, ce n'est pas de la quantification relative que vous faites mais de la quantification absolue. Donc pas besoin de gène de house keeping.

Pour la spécificité, généralement elle est déterminée en réalisant une melting curve en fin de réaction d'amplification avec du Sybr green pour contrôler qu'un seul fragment a été amplifié.

[invite513ac0a6]

En plus des conseils donnés au dessus, vu que tu travailles en quantité absolues, tu peux inclure (au moins dans les 1ers runs histoire de vérifier) des "matrix spikes" pour vérifier que rien dans tes échantillons biologiques n'interfère avec la PCR (c'est une méthode plus couramment utilisée pour les ELISA mais j'ai déjà vu des exemples montrant que ca vaut le coup de le faire pour une PCR).

Explication rapide (et fais un peu de recherches la dessus par toi meme pour plus de précision): tu dois introduire dans un échantillon biologique (appelons le X) une quantité connue (Y) de matériel (dans ce cas, ton plasmide). Tu run X tout seul, Y tout seul et (X+Y). A la fin, fais une simple addition, il faut que X seul+Y seul=(X+Y), ou du moins s'en approche au max (fais quelques recherches pour voir quel % de différence est considéré comme acceptable)

[Flyingbike]

Explication rapide (et fais un peu de recherches la dessus par toi meme pour plus de précision): tu dois introduire dans un échantillon biologique (appelons le X) une quantité connue (Y) de matériel (dans ce cas, ton plasmide). Tu run X tout seul, Y tout seul et (X+Y). A la fin, fais une simple addition, il faut que X seul+Y seul=(X+Y), ou du moins s'en approche au max (fais quelques recherches pour voir quel % de différence est considéré comme acceptable)

Pas mal, je ne connaissais pas la technique.

[invite87d28b5f]

Je vous remercie en tout cas, je vous remercie tous pour toutes vos réponses ça m'a permis de voir plus claire !