Validation de méthode

[vince515]

Bonjour,

Cette fois ci ma question sera plus d'ordre statistique voir mathématique pure. Mais concernant une étude chimique je pense être dans le bon endroit.

Je suis actuellement en stage dans une entreprise de champagne. Je dois valider une méthode d'analyse des amines biogènes dans le vin par HPLC et détection fluorimétrique.
Cependant pour la validation, il y a une étude de linéarité de la méthode (Etude des dispertions etc...).
J'ai 8 Amines Biogènes, avec lesquels je dois prouver la linéarité de ma méthode. Je sais que ma méthode est linéaire, cependant le test (Fisher) prouve une non linéarité. Je sais quelles valeurs empechent de prouver cette linéarité.
J'ai de ce fait soumis ces valeurs litigieuses aux tests de Grubbs et même de Cochran mais ceux-ci montrent aucune anomalie.
J'ai alors réitéré jusque 3 fois ma gamme, sans succes, avec pour derniers résultats une quasi linéarité pour chaque Amines Biogènes. (10>F_obs>F à 1%)

Que faire, n'éxiste-t-il pas d'autre test pour éliminer des valeurs? Renouveler la gamme qui présente des soucis est-il accepté dans une validation de méthode?
Cela fait 2 semaines et demi que je planche sur la question et je suis totalement incapable de trouver le probleme, la dernière ligne droite pour valider mon stage est bloquée par un mur de Pierre, et malheureusement je n'ai pas de marteau, ni de burin pour m'aider...

N.B: Les maths ne sont pas mon pécher mignon, pour le test de Grubbs et de Cochran j'ai réalisé un tableau excel qui étudie instanément mes valeurs, peut-être que je n'ai pas saisi completement les formules. Si quelqu'un se proposait, j'aimerais lui envoyer mes fichiers excel pour une petite étude de fonction?!
N.B2: Ma méthode est spécifique et sélective!

Merci d'avance
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[moco]

On manque d'information pour te répondre. T
Je recopie ta phrase en italique :
Je sais que ma méthode est linéaire, cependant le test (Fisher) prouve une non linéarité. Je sais quelles valeurs empechent de prouver cette linéarité.
Qu'est-ce que ce test de Fisher qui prouve une non-linéarité ? Et qu'est-ce que tu appelles "non-linéarité" ? Est-ce que tes points sont distribuées au hasard dans le graphique Oxy ?
Si tu obtiens des points sur Oy qui s'alignent à peu près en fonction de Ox, ce n'est peut-être pas bien linéaire, mais bon, il y a toujours des approximations dans tes mesures, des domaines d'incertitude.

[vince515]

Alors oui, j'ai du mal a exprimer mon souci, car je ne saisi pas trop moi même ce qui ne va pas.

Je vais expliquer de manière structurée espérant éclaircir mon probleme.

Je dois valider une méthode d'anlyse pour 8 Amines biogène par HPLC.
Pour ce faire j'ai établis une gamme étalon, dans une matrice vin (Pas le choix):
J'ai donc dopé en amines biogènes n=10 séries d'échantillon à des concentrations différentes:

Série 1 = Dopage à 0,5mg/L
Série 2 = Dopage à 1mg/L
Série 3 = Dopage à 2 mg/L
Série n = Dopage à x mg/L
Série 10 = dopage a 20 mg/L

N.B: J'introduis également un étalon interne dans chaque échantillons pour comprendre dans mon calcule les variances du dosage fluorimetrique.

J'ai donc une gamme de 10 échantillons a des concentrations différentes en A.B.. Les chromatogrammes respectifs me donne la surface des pics de mes 8 AMINES BIOGENES + surface du pic d'étalon interne.

Je calcule le rapport pour chaque analytes et chaque série:

Aire (A.B) / Aire (Etalon interne)

Qui me donne un nuage de point permettant le traçage d'une droite de regression avec 0.99< R² < 1 (=> Bonne regression linéaire)

J'obtient une équation de droite de la forme:
ax+b
avec
a = k = coeficient de réponse absolu
x = Concentration massique en Analyte ajouté
b = k* Concentration massique initiale de l'échantillon (ordonné à l'origine)

A partir de la je calcule donc :
Soit la concentration massique en analytes ajoutés que je correle avec mes dopages théoriques (Dans ce cas la correlation aura une valeur de comparaison et une valeur d'étude de linéarité).
Soit la concentration initiale de la solution que je corrèle également avec mes dopages théoriques (Dans ce cas, la correlation n'aura pas de valeur de comparaison mais uniquement une valeur d'étude de linéarite)

Alors la ça se corse.
Comme pour toute validation j'ai réalisé 3 répétitions pour chaque série.
Ces valeurs de concentration je les rentre dans un fichier excell qui s'occupe de calculer tous ce qu'il faut que je sache pour la validation (D'où mon incertitude lorsque je dis que c'est d'apres la loi de Fischer).
Ceci dit Pour que ce soit linéaire La valeur inscrite en tant que Fobs doit être inferieure a F1% (d'ou ma supposition du test de fischer).

N.B: J'ai cru comprendre que l'écart type, les résidus, le carré moyen du résidus faisaient partis du calcule (Je ne sais pas du tout ce que tout cela signifie)
N.B2: Plus la dispertion des répétitions pour chacune de mes 10 série est grande, plus la méthode tend à être linéaire.

Je résume:
J'ai 10 série que j'ai répété chacune 3 fois pour l'analyse.
Si j'enlève la série qui me parait la plus écarté sur la courbe des résidus, ma méthode devient linéaire. Mais lorsque je soumet cette série au teste de Cochran (qui compare les variances) ou de Grubbs (compare les valeurs aberrantes), ils me répondent qu'il y a aucune anomalie (nan ils ne parle pas vraiment mais facon de parler )
Que faire?! :s
Déjà un grand merci moco de bien vouloir m'aider si tu le peux =)

[moco]

Je ne vois ni pourquoi tu t'inquiètes, ni de quoi tu t'inquiètes ..
Tu as des mesures qui jouent, avec un bon coefficient de corrélation. Elles ne sont pas idéales, bien entendu. Mais c'est la vie !
Il semble que de temps en temps tu aies des mesures aberrantes. Cela peut arriver à tout le monde. Tu les élimines. Ceci fait, ton programme te dit qu'il n'y a aucune anomalie. Pourquoi s'inquiéter ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[vince515]

La où je m'inquiète et qui est très dérangeant pour ma part, c'est qu'éliminer ces valeurs est illogique d'après le principe de validation.

Le système de validation d'une méthode de dosage chimique tient sur 3 paramètres principaux : La linéarité, la spécificité et la détermination des Limites de quantification et des limites de détection.

Dans le principe de validation (en tout cas dans mon laboratoire), toute suppression d'une valeur, d'une série, ou d'une gamme de données, n'est pas autorisée sans avoir effectuer un test (Tel Cochran ou Grubbs) qui te le permet.
En gros, c'est comme si je jouais au mikado avec mes données en faisant tout trembler ^^
On m'a glissé officieusement la possibilité d'arranger à ma sauce, mais ce n'est pas scientifique et ça ne me plait pas.
C'est pourquoi peut-être qu'il éxiste un test dont je ne connais pas l'éxistence. (Chose qui me parait plus plausible vu mon allergie à la manipulation algébrique)

Est-ce que à ton avis je peux utiliser le rapport |valeurs mesurée - Valeurs théorique|/ Valeur théorique ? avec Valeurs théorique <> 0

Merci pour tes réponses rapides =)

[JereN]

Bonjour,
quelques valeurs aberrantes dans une gamme de 10 séries de mesures, c'est malheureusement assez courant et, avec les méthodes de validation traditionnelles, on se perd vite dans tous les tests statistiques.
S'il te reste un peu de temps avant la fin de ton stage, je te conseille de vérifier la validation de ta méthode à l'aide du "profil d'exactitude". C'est une nouvelle approche qui repose sur une limite d'acceptabilité et qui évite de multiplier les tests statistiques dans tous les sens.
Pour plus d'info, voir entre autres l'article de Max Feinberg ici ; il a même sorti un bouquin sur le sujet en 2009 : "Labo-stat"...

[vince515]

Il me reste uniquement cette semaine pour valider la méthode. Je vais essayé de répéter le principe de "profil d'exactitude" comme tu me l'as indiqué, espérant l'arrangement de mon probleme.

Merci en tout cas pour cette nouvelle piste de reflexion!!

Chapeau melon

[Miss Hodgkin]

Salut,

J'avoue que j'ai du mal à comprendre le problème (sans voir tes résultats c'est pas facile).
Par contre ce que je peux te dire c'est que le test de fisher (comparaison des variances) ne permet pas de savoir si ta réponse est linéaire. Le test F permet de savoir si ta pente est significative ou non.
J'ai l'impression que tu te perds un peu dans les statistiques donc voilà un petit résumé. Pour vérifier la linéarité d'une méthode il faut vérifier 3 choses :

- Est ce que tes variations sont bien expliquées par ton modèle ? Pour ça, tu vérifies le coefficient de corrélation R (en général, on le veut > 0,99, mais tout dépend de tes critères, surtout que tu as une matrice complexe).

- Est ce que la pente est significative ? Là, il faut faire le test de fisher sur les variances. Hypothèse H0 : pas de différences entre les variances, il n'y a pas de relation entre tes x (concentration) et tes y (réponse) ; H1 : il y a une différence entre les variances, la pente est significative. Si Fcalculé < Ftable, H0 est acceptée, si Fcalc>= Ftable, H1 est accepté.

- Est ce que la droite passe par zéro ? Tu fais un test de Student : H0, les valeurs sont égales, la droite passe par zéro, H1, les valeurs sont différentes, la droite ne passe pas par zéro. Si tcalc<ttable, H0 est acceptée, si tcalc>=ttable, H1 est acceptée.

Pour les test de fisher et de Student, tu les fais en choisissant une risque, donc ils peuvent ne pas être bon à 98% et bon à 95%, à toi de voir ce que tu veux...

Et puis ces tests ont des limites, par exemple, plus tu es précis dans tes mesures, plus le test de Student risque de ne pas passer. Il faut étudier tous tes résultats, et tu peux aussi valider une méthode qui ne satisferait pas tes premiers critères si tu juges que l'erreur faite n'a pas d'incidence sur tes mesures.

J'espère t'avoir un peu aidé, bon courage en tout cas.

[vince515]

Bonjour miss Hodgkin!

Oui tu viens de m'expliquer quel était le mécanisme de retour du programme. Et je t'en remercie!

Cependant, j'ai compris que mes valeurs n'avaient pas une dispersion Homogène et que c'était ça qui coinçait.
Du coup ma réel requête (ormis une idée de génie) était de trouver un test qui m'aurait permis de supprimer les valeurs qui me donnaient une dispersion inégale afin de conclure à la linéarité de ma méthode.
Chose que Cochran et Grubbs ne me permettaient pas.

Cependant, supprimer des valeurs est toujours ambetant, surtout que j'ai des gammes pour lesquelles les Y retours sont identiques ou presques et d'autres pour lesquelles les Y retours sont dispersé (tout en restant intuitivement dans le vrai => Y retours proches de X théoriques).

C'est pas évident à expliquer:
D'une par pour des soucis terminologique
d'autre part du fait de mes connaissances restreintes.

De ce fait je me suis tourné vers le profil d'exactitude, mais ton explication m'a permis de compléter mon rapport Un grand merci!!!

En passant j'en profite, si quelqu'un manipule ou étudie le profil d'exactitude, pourrait-il m'expliquer, avec des mots simples en quoi il y a validation?! Et en même temps comment calculer les limites (intervalles de tolérance et intervalles de tolérance relative?!)

Ca m'énnerve de devoir tout demander, mais j'ai trop peu de temps pour me familiariser avec les acrobaties algébriques que ça représentent!

Merci d'avance