principe d'électrophorèse

[invitea41b37f0]

Bonjour à tous , je n'arrive pas à comprendre le principe de l'électrophorèse malgré l'avoir déjà utilisé.
Je sais que les fragments d'ADN sont chargés négativement et qu'ils seront attirés par la cathode positive , qu'il y a un gel d'agarose qui permet le déplacement + ou - facilement en fonction de la taille etc.
Seulement lorsqu'on essaye de les séparer , on met chaque fragment dans un puits différent , comment sont ils alors attiré vers la cathode ? Je veux dire par là que ça m'a tout l'air d'être un circuit électrique or les fragments n'ont pas d'autres choix que de descendre vers le fond du puits. Je ne sais pas si ma question est claire ? EN gros je ne vois pas le rapport entre le principe théorique ( d'etre attiré par la cathode) et la séparation ( les bandes qu'on voit aux UV) ?
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[Saswordz]

Bonjour,

Il faut bien que tu distingues les deux parties de ta question, tout d'abord la migration, puis ensuite la révélation.
Pour ce qui est de la migration, tu mets ton ADN proche de l'anode, il va donc y avoir répulsion entre l'ADN et le pôle chargé négativement, l'acide nucléique va donc migrer.
Pour ce qui est de la révélation (les bandes vues aux UV), elles sont obtenues grâce à un composé présent dans le gel ou que tu ajoute par la suite (souvent du BET si je ne me trompe pas).

J'espère avoir répondu à ta question.

[invitea41b37f0]

Sans doute mais je ne visualise toujours pas. Imaginons on rempli seulement un puits , quand vous dites qu'il va migrer , il va migrer horizontalement ou verticalement ?

[Saswordz]

Bah tout dépend du gel. Un gel d'agarose est horizontal (donc migration horizontale), un gel de polyacrylamide est vertical (donc migration verticale).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea41b37f0]

Pouvez vous détailler svp ?

[Saswordz]

Je ne vois pas quoi dire de plus.
Le gel d'agarose va être coulé à plat , avec un pôle à droite et un pôle à gauche. Les molécules vont donc migrer de droite à gauche (ou inversement en fonction de la position des pôles).
Le gel de polyacrylamide va être coulé verticalement, avec un pôle en haut et l'autre en bas. Les molécules vont donc migrer de haut en bas.

La migration dépend donc du type de gel utilisé.

[invitea41b37f0]

Je viens de comprendre merci
Dans l'etape de révéltation puis-je vous poser une autre question ?
On utilise des standards qui sont utilisé en même temps et on sait mesurer exactement la position des fragments prp aux références.
Mon prof dit qu'on peut arriver à une précision de +- 3 paire de bases pour les fragments les mieux séparés mais que plus on monte dans le gel, plus ce sera difficile de mesurer avec précision la taille des fragments. Pouvez-vous me clarifier son dernier propos ?

[Saswordz]

Déjà il faut bien dire que cette précision ne peut être obtenue qu'avec un gel en polyacrylamide.
Mais pour ce qui est des propos de ton prof je ne comprends pas trop, il parle du haut du gel, donc des fragments les plus gros. Peut-être que les gros fragments ont trop de bases pour bien distinguer mais je n'en sais pas suffisamment pour t'informer là dessus.

[invitea41b37f0]

Ok merci. savez-vous pourquoi on met un tampon au dessus du gel ?

[Saswordz]

Il faut bien que le courant électrique se propage, le tampon est là pour ça.

[invitee863e61a]

Le tampon est une solution dont le pH et la teneur en ions sont bien fixés, ça permet d'un gel à l'autre d'avoir des migrations reproductibles. Les sels permettent au courant de passer sans que le gel ne chauffe (ça arrive que des étudiants mettent de l'eau déminéralisée par erreur et là ça chauffe, les gels fondent, etc)

[invitea41b37f0]

vous voulez dire que selon le type de gel qu'on utilise on s'arrange pour que le pH de la solution soit toujours le même pour que la migration soit reproductible ? en quoi le pH peut différer ? sur le plan cinétique ?