Résultats PCR quantitative

[invite3160cfa5]

Bonjour à tous,
Je lance un sujet qui a déja été posé plusieurs fois, néanmoins je n'arrive pas à trouver ce que je souhaite dans les différents topics.
Je cherche à montrer la modification de l'expression de gènes dans une lignée cellulaire au cours du temps et des différents stimulus (traitements). Mon échantillon contrôle étant la lignée sans traitement au T 24h post-ensemencement.
J'ai désigné mes amorces, mis au point ma PCR, calculé l'efficacité pour chacun de mes gènes d’intérêts (avec différentes dilutions de RT).
Le problème c'est que toutes mes efficacités ne sont pas égales à 100% donc je ne peux pas utiliser la méthode des ΔΔCt.
Comment procéder pour pouvoir comparer mes différents résultats quant les efficacités ne sont pas égales? Quelle méthode de quantification utiliser?
Merci d'avance,
Akane
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[Flyingbike]

donnez nous quelques exemples de valeurs ou de courbes d'efficacité. Parce que là on ne peut pas faire grand chose, on ne sait pas si on parle de 90% ou 50%.

si vous avez réalisé des courbes de gamme, c'est justement pour pouvoir comparer des valeurs avec une efficacité inférieure a 100%, puisque ca vous permet de transformer un Ct (absolu) en concentration (relative). Si vous avez une bonne corrélation log[c]<=>f(Ct), vous pouvez comparer les concentrations relatives sans vous préoccuper des différences d'efficacité.

[TanguyE]

Bonjour,

Voici la méthode à partir de laquelle la méthode des ΔΔCt à été déduite: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc55695/

Pour les efficacités, si vous n'êtes pas dans la zone 90-110%, c'est pas terrible. (ça peut amener à se faire refuser des publis)

Cordialement

[invite3160cfa5]

Tout d'abord merci pour pistes...

Mon efficacité la plus basse est de 86% sinon toutes les autres sont effectivement comprises entre 90 et 112%.
Je viens de télécharger l'article. Du coup le ratio suite à l'utilisation de la formule qui y est proposée,

Ratio= (Etarget ^[ΔCt target (control-sample)])/(Eref ^[ΔCt ref (control-sample)])

Comment l’interprète t-on? Est-ce que c'est comme le 2^ΔΔCt, ou si le chiffre obtenu est > 2 on a une a une sur expression, s'il est compris entre 0.4 et 2, l'expression est considérée comme stable et <0.4 sous-exprimé??

Sinon Flyingbike j'ai effectivement de bonne corrélation log[c]<=>f(Ct), le r2 des mes courbes (5 points allant d'une dilution au 1/5 à 1/500) est toujours au moins 0.99. Dans ce ca la on pourrait réellement comparer les concentrations relatives sans vous préoccuper des différences d'efficacité? comment?

Merci beaucoup,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3160cfa5]

Tout d'abord merci pour ces pistes...

Mon efficacité la plus basse est de 86% sinon toutes les autres sont effectivement comprises entre 90 et 112%.
Je viens de télécharger l'article. Du coup le ratio suite à l'utilisation de la formule qui y est proposée,

Ratio= (Etarget ^[ΔCt target (control-sample)])/(Eref ^[ΔCt ref (control-sample)])

Comment l’interprète t-on? Est-ce que c'est comme le 2^ΔΔCt, ou si le chiffre obtenu est > 2 on a une a une sur expression, s'il est compris entre 0.4 et 2, l'expression est considérée comme stable et <0.4 sous-exprimée??

Sinon Flyingbike j'ai effectivement de bonne corrélation log[c]<=>f(Ct), le r2 des mes courbes (5 points allant d'une dilution au 1/5 à 1/500) est toujours au moins 0.99. Dans ce ca la on pourrait réellement comparer les concentrations relatives sans vous préoccuper des différences d'efficacité? comment?

Merci beaucoup,

[Flyingbike]

On procède comme pour les ∆∆Ct : il faut normaliser les concentrations par rapport à un gène de ménage, ensuite on peut exprimer les différence d'expression entre les différentes conditions comme un ratio