Problème dosage microBCA

[invitea6e5372b]

Bonjour,
Je souhaite réaliser un dosage de protéines sur lysat cellulaire avec la méthode microBCA ; Les cellules sont lysées avec du tampon RIPA (Tris 50mM, NaCl 150mM, SDS 0.1%, Sodium deoxycholate 0.5%, Triton X100 1%). J’ai d’abord fait un test en réalisant des gammes étalons de BSA diluée dans différentes solutions (RIPA, RIPA dilué au 1/3 dans de l'eau distillée, eau distillée). Avec le RIPA pur, quelque soit la concentration protéique l'absorbance relative est toujours nulle… à quoi cela peut-il être dû ? Est-ce le tampon de lyse qui est trop dénaturant? Quelle méthode de lyse cellulaire pourrais-je utiliser pour contourner ce problème?
Merci
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[Flyingbike]

Visiblement aucune incompatibilité : http://www.piercenet.com/files/TR006...patibility.pdf
votre RIPA est il correctement préparé ? est ce qu'une gamme dans l'H20 fonctionne bien ? (pour éliminer un probleme de kit BCA)

[invitea6e5372b]

La gamme en H2O marche très bien. J'ai également testé avec du RIPA prêt à l'emploi de chez sigma pour éliminer d'éventuelles erreurs de préparation, même résultat que pour le RIPA "fait maison". Avec du RIPA dilué au 1/3 dans l'eau distillé j'obtiens un résultat "intermédiaire" : la gamme est bien linéaire, mais les absorbances mesurées sont nettement moindre qu'avec la gamme diluée en H2O.
J'avoue que je coince un peu...

[Flyingbike]

étrange en effet, la table que j'ai citée donne des indications d'interférence mais on est bien en dessous avec votre RIPA.

vous lisez bien a 562 nm ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea6e5372b]

Je lis à 560nm, le lecteur de plaque auquel j'ai accès ne permet pas de lire à 562nm, mais normalement ça ne devrait pas changer grand chose...
En fait le problème que j'ai ce n'est pas que le tampon seul interagit de façon excessive avec le réactif (le blanc n'est pas limpide mais ça reste très acceptable), c'est simplement qu'en présence de protéines même à de fortes concentrations par rapport à ce que préconise la notice du kit, je n'obtient pas la coloration escomptée quand j'ajoute le réactif si la gamme a été faite dans du RIPA.