Triple transfection

[Enialix]

Bonjour a tous,

Pour pouvoir infecter des cellules avec un lentivirus, je dois tout d'abord "créer" ce virus en effectuant une triple transfection.

Pour cela, je compte utiliser la lipofectamine et transfecter des cellules HEK293FT.

Quelqu'un a-t-il un protocole pour ça?
Je ne sais pas si je dois mélanger mes trois plasmides dans un même tube, puis combiner tout ça avec la lipo ou si je dois combiner chaque plasmide avec la lipo puis ensuite mettre le tout sur mes HEK.
De même, je pense qu'il faut utiliser un même nombre de chaque plasmide (en tenant compte de leur taille respective) plutôt que de mettre par exemple 4ug de chaque (je bosse en plaque de 6 puits).

Je n'ai aucun soucis avec les simples transfections qui fonctionnent vraiment très bien, mais je bloque depuis plusieurs semaines avec ça, et comme dirait l'autre "ça m’énerve"!

Merci d'avance,
Enialix
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[Enialix]

Personne n'a une petite idee?

[TanguyE]

Bonsoir,

Un peu de patience, des idées on en a plein, du temps un peu moins

Pour avoir déjà pratiqué la triple transfection sur des 293, ça ne m'a jamais posé de problèmes, bien que le FT me laisse songeur (et que j'ai la flemme de chercher).

Donc oui, prépare toutes tes dilutions de tes trois plasmides dans un seul tube avant de rajouter la lipo.
Et en effet mettre le même nombre de plasmide est mieux que des quantités d'ADN arbitraire surtout si tes plasmides sont vraiment différents en taille. Veille aussi à ne pas dépasser la quantité maximale d'ADN à transfecter dans chaque puits (qui est la même que pour une transfection simple).

Pour la réalisation, rien de plus compliqué qu'une transfection simple si ce n'est quelques calculs de dilution supplémentaire.

cordialement

[Enialix]

Merci de ta réponse.

C'est vrai que j’étais un peu impatient, je voulais faire ça aujourd'hui, mes cellules étaient prêtes et belles ^^.
Du coup j'ai déjà fait plusieurs fois la manip telle que tu le conseille, et ça n'a pas fonctionné.

J'ai donc tenté de faire un tube par plasmide, avec le même nombre de plasmide dans chaque tube. On verra bien ce que ça donne.

En ce qui concerne les FT, la personne qui me les a donné m'a dit que le F correspondait a Fast. Et que ce serait donc des 293T, mais plus rapides (A noter que je n'ai pas vu de différence de croissance entre les FT et les T).

[A voir en vidéo sur Futura]

[TanguyE]

N'ayant pas l'expérience des lentivirus, peux tu me dire ce que tu considère comme une manip ratée? Pas de lenti dans le milieu? Forte cytotoxicité induite par la transfection?

Parce que moi j'ai toujours fait mes mix de plasmides, ajouté la lipo par dessus, déposé le mélange après incubation sur mes cellules et hop récupération tranquille de mes cellules à J2 ou J3.

Quelle quantité totale de plasmides tu transfecte?

Si j'ai d'autres idées qui me viennent je te tiens informé.

[Enialix]

J'utilise 4ug d'ADN (au total), par puits sur plaque de 6 puits (comme je le fais pour les transfections simples).

Je considère que la manip est ratée quand je n'ai aucune preuve que mes cellules pulmonaires ont été infectées par le lentivirus (je le produis chez les HEK pour infecter des cellules pulmonaires). Les quelques premières fois, j'utilisais un système qui devait faire exprimer la GFP en même temps que ma protéine d’intérêt, mais aucune cellules pulmonaires ne semblait exprimer la GFP.
Je me suis dit que cela pouvait provenir du plasmide et ai choisi un système de sélection a la puromycine. Je transfecte mes HEK, je récupère le surnageant, je l'utilise pour infecter mes cellules pulmonaires, je sélectionne a la puromycine, et tout le monde meure ^^.
Voila des bonnes manips ratées pour moi.

Merci encore de ton aide,
Enialix

[TanguyE]

Encore une fois je n'ai jamais fait de lenti, mais je pense que si tu avais un moyen de tester la présence de ton lenti dans le milieu de culture des 293, ça pourrait t'aider à identifier l'étape qui ne va pas.

Parce que si ni une sélection antibio, ni un rapporteur GFP ne fonctionne sur tes cellules pulmonaires, c'est que le problème est avant. Mauvais assemblage du lenti, transfection toxique...