Interférence à l'ARN

[invite8d27bda6]

Bonsoir,

Pour introduire un cours sur l'interférence à l'ARN, on nous a montré une experience 1990 qui avait pour but de foncer des pétunias en injectant un transgène codant pour la Chalcon Synthase, impliquée dans la synthèse des pigments. La grande surprise fut qu'on a obtenu des pétunias qui étaient "décolorées" par endroit.
Ensuite, on s'aperçoit que lorsqu'on injecte de l'ARN double brin GFP dans une lignée transgénique de Caenorhabditis elegans qui possédaient le transgène de la GFP, son expression s'éteint : les vers ne sont plus fluorescents.
Et puis à la fin, on explique que seul un ARN double brin peut dégradé par DICER, l'éminceuse puis être pris en charge par le complexe RISC.
Donc est-ce que je dois comprendre que pour le cas du Caenorhabditis elegans, l'ARN exogène double brin codant pour la GFP est émincé par DICER puis RISC s'en sert comme "guide" pour éliminer tous les ARNm semblables ? Ca expliquerait pourquoi le gène s'éteint Pour être sûre d'avoir bien compris pouvez vous me confirmer ça :
Un ARNm est trancrit par la cellule. Il s'accole avec un ARN antisens (codé par le génome de la cellule ? Est-ce que c'est ce qu'on appelle des miARN ?) puis DICER le morcelle et RISC s'en sert pour éliminer le reste ?
Par contre pour les pétunias, je ne vois pas. A quel moment on obtient de l'ARN double brin ?
Encore une autre question (enfin, 2) : que sont les shARN ? Quel est leur mode d'action ?
Voilà, merci beaucoup pour votre aide !
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[invitee4e79868]

Bonsoir!

Et bien, il semblerait que vous avez compris l'ensemble!
Pour reprendre ce que vous avez dit :
le siRNA est un petit ARN (environ 20 nucléotides), complémentaire à un région d'un ARN cible. Il va donc s’appareiller, ce qui va former une ARN double brin. Les ARN double brin sont anormales pour la cellule (on peut dire qu'elle le voit comme l'information génétique d'un virus). Elle a donc des systèmes pour les reconnaître, dont fait partit DICER. Cette protéine et l'ARN double brin va alors activer Ago, du complexe RISC. Ago va alors séparer l'ARN double brin en deux simple brin, garder la séquence d'ARN "guide", qui permet de reconnaître l'ARN cible (généralement, la séquence du siRNA) et dégrader l'ARNm. Puis Ago va "patrouiller" dans la cellule avec l'ARN "guide", afin de soit de degrader tout ARN complètement complémentaire, soit bloquer la traduction s'il y a une partiellement complémentaire.

On distingue différent type d'ARN interférence :
- les miRNA, pour micro ARN. Il s'agit des ARN interférants naturelles, codés par la cellule. On en dénombre environ 1000 pour une cellule animale ou végétale, dont approximativement 60% cible des gènes cellulaires.
- les siRNA, pour small interferance. Comme je l'ai dit plus, il s'agit de courte séquence d'ARN simple brin, directement injecté dans la cellule. Ils sont généralement très spécifique, mais de type "one shoot", c'est à dire qu'une fois que les siRNA ont tous été utilisé par la cellule, l'ARNm de la protéine peut de nouveau être traduit.
- les shRNA, pour small hairpin. Ces ARN interférants sont aménés dans la cellule par transfection (plasmide) ou infection (lentivirus, AAV, adénovirus). Il y a ainsi production par la cellule de shRNA, dirigé contre l'ARNm de la protéine d'interêt. Pour détailler un peu plus les shRNA, ils sont transcrit comme n'importe quelle protéine, mais ils possèdent la particularité d'avoir une séquence complémentaire en mirroir. Ils sont donc capable de se replier, pour former un ARN double brin artificielle, mais bien reconnu par le complexe RISC.

Enfin, pour vos pétunias, je ne sais pas, mais je pense que ces scientifiques ont directement envoyés dans la cellule de l'ARN double brin, ou peut-être un hybride ADN/ARN.

En espérant avoir répondu à vos questions

[invite444a246d]

Mes cours sur le RNAi remontent a loin, mais il me semble me rappeler de quelque chose qui évoquait une contamination par du double brin avant/pendant/après la transfection. J'ai la flemme de faire de la bilbio pour ca, je te laisse creuser la piste .

Cham

[invite8d27bda6]

Merci beaucoup pour l'explication trés détaillée ! J'ai compris maintenant !
J'aurais une autre question : comment fait-on pour introduire un gène d'un plasmide par recombinaison homologue ?
Je crois que j'ai mal saisi le principe...
Merci d'avance !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea142fd95]

Merci beaucoup pour l'explication trés détaillée ! J'ai compris maintenant !
J'aurais une autre question : comment fait-on pour introduire un gène d'un plasmide par recombinaison homologue ?
Je crois que j'ai mal saisi le principe...
Merci d'avance !

Salut,
Pour intégrer un gène par recombinaison homologue, il faut que ton gène d'intérêt possède des séquences flanquantes homologues à la région où tu veux l'insérer. Après si tu veux savoir toutes les étapes, ça sera avec plaisir que je te les donnerai

[invite8d27bda6]

C'est trés gentil, oui je veux bien avoir toutes les étapes
Merci !

[invitea142fd95]

Alors je reprends pour la recombinaison homologue (RH) :

Ton gène à introduire (que j'appellerai gène X) doit posséder des séquences homologues à celles situées entre le gène d'intérêt (que j'appellerai gène Y) à muter. Ton transgène plasmidique X est :
- soit une version mutée du gène Y, soit un autre gène Z = méthode knock-in
- soit une simple cassette de gène de résistance à un antibio par exemple = méthode knock-out.

Si tu fais du knock-in, il faut en plus de ton gène X, un marqueur de sélection comme un gène de résistance aux antibio ou un gène pour l'auxotrophie.

Le plasmide doit être linéarisé pour que les enzymes recombinases soient actives. Grâce à la RH, ton gène X sera introduit à la place du Y. Cependant, la RH n'est pas optimale selon le modèle biologique car un autre mécanisme de réparation de l'ADN est présent, le "Non Homologous End Joining" (NHEJ) qui empêche la RH car le transgène s'insère de façon non-spécifique. Tu utiliseras alors un système de sélection par la thymidine kinase et ganciclovir (je sais pas si tu connais ...).
Pour en revenir au RH, tu sélectionnes ensuite tes cellules sur milieu avec antibio : celles qui survivent ont eu le transgène intégré.

Si tu as d'autres questions n'hésite pas.

[invitee4e79868]

Moi, j'ai une question!!

Je croyais maintenant que la plupart des recombinaisons se faisaient par la Cre recombinase (avec les séquences Cre, il me semble).
Mais je me suis toujours demandé comment elle pouvait fonctionner, car si j'ai bien compris, il faut également des séquences Cre dans le génome receveur... Comment cela fonctionne-t-il exactement?