Meilleure résolution pour gel d'agarose

[TanguyE]

Bonjour à tous,

J'ai une petite question à vous soumettre.

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction . Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.

Et c'est là que ça devient drôle (ou pas): bande 1 de 1680pb, mon gène de 1389pb, bande 3 de 1217pb. Du coup c'est un peu la galère d'extraire la bande du milieu de mon gel...

On arrive enfin à ma question: comment je pourrai faire pour améliorer la discrimination de mes bandes sur mon gel? J'ai testé de passer de 1% d'agarose à 0.8%, c'est un peu mieux mais pas mirobolant. Des idées? Sachant que je fait migrer 5min à 70V puis 25/30min à 150V. Si je diminue le voltage, ça sera mieux?

Merci d'avance!
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[biseibutsu]

Bonjour,

Non, diminuer le voltage ne va pas augmenter la résolution de ton gel.

Par contre, il est possible de faire des gel d'agarose à plus de 2%. Vu que tes bandes sont petites (moins de 2kb, c'est petit pour moi), tu auras des bandes plus fines et mieux résolu. Il est également possible de monter à 5% d'agarose (avec une astuce), mais je ne pense pas que cela soit très recommendé (pour le coups, les mailles risquent d'être trop serré)

Une autre solution bateau, c'est augmenter la longueur de ton gel, puis faire migrer plus longtemps (jusqu'à ce que le marqueur de taille 1kb sorte du gel par exemple.). Le problème de cette méthode, c'est que tes bandes seront moins fine, donc plus difficile à découper/purifier.

La dernière solution, c'est faire le combo des deux précédentes. Avec 10 cm de gel à 2% et une bonne migration, il est possible de séparer 500 et 550 pb sur un gel. Donc 1200 et 1400 doit également être possible

[TanguyE]

Salut!

Merci de ta réponse, au début j'avais pensé recouper la bande de 1217pb qui me gène mais j'ai pas trouvé d'enzyme qui me soit utile dans notre stock et j'ai pas envie de claquer 300$ pour ça. Je vais donc tester du 2% en migrant plus longtemps pour voir ce que ça donne.

[gorben]

Le plus simple c'est surtout de ressortir ton gene via PCR et de digerer le produit PCR

[A voir en vidéo sur Futura]

[nowell]

Bonjour,

Sinon, coupez les séquences qui gonflent de 1600pb et 1200pb en 2 pour avoir en gros 2x800 et 2x 600 pb.
j'avais une séquence la semaine dernière différente de 270pb par rapport à mon DNA d'intérêt, je l'ai coupé en 2 et hop ! Purif sur gel comme tu peux pas test^^.
Sérieusement, soit vous faites une PCR avec des amorces à gauche et à droite de votre DNA d'intérêt soit vous coupez les séquences de DNA et faites migrer sur un gel d'au moins 2% 30min (voire 1h , à vous de tester) à 135V. Et prenez un intercalant performant type GelRed.

Une autre solution vient de me traverser l'esprit: faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.

Cordialement
nowell

[TanguyE]

Merci pour les réponses

Pour la PCR, j'y tiens pas forcément, j'ai passé trop de temps à codon-optimiser ma séquence et j'ai pas envie de faire foirer ça à cause d'une erreur de polymérase.

Et niveau enzymes, j'y avait pensé également mais j'en ai pas trouvé dans notre stock qui soit intéressante et j'ai pas envie d'en commander juste pour ça.

J'ai donc opté pour la migration sur 1h, c'est pas très joli mais j'ai pu découper convenablement