Bonsoir
je suis entrain de réaliser un clonage
j'ai voulu digérer quelques plasmides afin de confirmer s'ils sont recombinants ou non , 6 plasmides parmi 7 ont été digéré sauf un !
j'ai fait plusieurs essais mais j'ai obtenu toujours le même résultat !! le même plasmide ne se digère pas !!
Quelle peut être la cause ?
Bonsoir
Je vous envoie tout ce qui me vient à l'esprit en vrac ... peut-être une idée dans tout cela.
Je viens de sortir d'un troubleshooting de 2 semaines de clonage^^.
1-Votre plasmide n'est pas celui que vous croyez, une erreur d'étiquetage, ça va tellement vite....
2-Une malheureuse mutation de votre site de restriction ? peu probable...
3-Une extrémité de votre recombinant qui n'est pas insérée correctement ?
4- Vos recombinants sont issus de purif sur gel ? d'amplification PCR ? Beaucoup de possibilités: vous n'avez pas sélectionné la bonne bande sur gel, ou alors vous êtes planté dans les amorces de PCR, expliquant l'absence d'un site normal de restriction.
5- Votre enzyme est morte pour cette coupure ? Ou alors mettez vous le bon buffer de restriction ? Ajoutez vous de la BSA ?
6- Votre gel est-il assez discriminant pour les tailles de fragments recherchés ? l'agent intercallant est-il adapté (Gelred vs BET ?) ça se trouve vous avez coupé le plasmide, mais ne le voyez pas.
7- j'allais oublier la dernière possibilité : Votre plasmide n'est effectivement pas recombinant, essayez de recommencer votre insertion. Si vous le pouvez faites une infusion, ça marche plutôt bien quand on sait s'y prendre.
Envoyez votre protocole en entier, détaillé, carte de restriction du fameux plasmide comprise, si vous le désirez, je verrai si je vois un truc qui saute aux yeux.
Cordialement
Nowell
merci beaucoup pour votre réponse détaillée))
voilà la carte de restriction de mon plasmide
http://www.snapgene.com/resources/pl...EX-4T-1_1x.png
j'utilise les enzymes BamH1 et Not1
je n'utilise pas la BSA
mon agent intercalant est le BET
j'ai un autre problème
l'ADN plasmidique des clones extrait par miniprep se visualise sur gel sous 2 formes , l'une linéaire d'environ 5kb , l'autre circulaire de 3 kb
tous les clones qui ne sont pas recombinants se digèrent et se linéarisent à 5kb (comme mon plasmide témoin)
j'ai 2 clones qui sont digérés mais je trouve sur le gel 2 bandes l'une d'environ 5.5 kb ( mon insert est de 486 pb)
et une autre bande très fiiine de 5kb et comme d'habitude j'ai fait plusieurs essais en augmentant chaque fois la quantité d'enzyme mais rien n'a changé
en utilisant les 2 enzymes à la fois j'obtiens le même résultat :////
j'arrive pas à confirmer si c'est un clone recombinant ou non
