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[TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1




  1. #1
    OffspringFan

    [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    Bonjour à tous,

    Je dois réaliser pour mardi le compte-rendu de mon tp sur la séparation des molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne mais je me retrouve bloquée aux questions de chimie...

    Le principe est simple : on dispose d'une colonne à l'intérieur de laquelle on place un gel (Sephadex G50) qui va permettre de séparer différents constituants selon leur taille (rayon de Stokes). On cherche à séparer deux protéines (la thyroglobuline -->protéine incolore de 669000 daltons et le cytochrome c --> protéine porteuse d'un hème coordiné à un atome de Fer qui lui donne sa couleur rouge de 12400 daltons) et un sel (le dichromate de potassium --> sel de couleur jaune de 294 daltons). Le but du TP est de séparer ces trois constituants, détecter les molécules, doser les protéines et le cytochrome c.

    Ces 3 constituants se trouvent en solution dans 200micro litres de tampon d'élution [Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5 ; NaCl 0,3 mol/L ; thimerozal 0,005% (antibactérien)] et il est noté : - thyroglobuline 12,5 mg/mL
    - cytochrome c 5 mg/mL
    - dichromate de potassium 2,5 mg/mL

    La première manip consiste à déposer ces 200micro litres au dessus du gel et de rajouter par dessus du tampon d'élution tout en récoltant par le bas de la colonne des fractions de 2mL pour les deux premières et 1mL pour le reste (jusqu'à 17 fractions). On a alors comme résultat : un produit rouge de la 4ème à la 11ème fraction et jaune de la 12ème à la 16ème fraction.

    Les deux et troisième manip du TP consistent à établir la gamme étalon du cytochrome c par dilution d'une solution-mère à 0,5mg/mL dans différents volumes et mesure d'absorption à 408nm ainsi que la gamme étalon pour le dosage des protéines grâce à une solution de BSA (albumine sérique de boeuf) à 1mg/mL avec du bleu de coomassie (méthode de Marion S. Bradford).

    La manip suivante consiste à mesurer l'absorbance de nos fractions contenant le cytochrome c (rouge) et celles contenant le dichromate de potassium (jaune). Grâce à la gamme étalon du cytochrome c, on a pu obtenir la quantité de cytochrome c de nos fractions, en mg.
    On a ensuite dû prélever 20micro litres des fractions 1 à 11 (la dernière contenant les dernières molécules de cytochrome c) et d'y rajouter 1mL de bleu de Coomassie permettant de mettre en évidence la présence des protéines. Avec la gamme étalon du BSA, on a pu obtenir la quantité de protéine pour ces fractions, en micro g.

    Voilà pour l'aspect pratique du TP mais place aux questions !

    - Première : Calculer la quantité (masse) de chacun des produits déposés sur la colonne (présent dans le mélange initial). Je comprend qu'il faut calculer la masse de cytochrome c, dichromate de potassium et thyroglobuline présents dans les 200micro litres de tampon d'élution du début mais ce que je ne comprend pas c'est cmt y parvenir ? J'essaie de m'aider des indications 5mg/mL, 2,5mg/mL...mais ca ne me donne rien de concluant. Je ne vois pas quoi utiliser comme formule ni même comme donnée. Ce qui me bloque par la suite.
    - Deuxième question : Calculer le rendement de purification du cytochrome c après passage dans la colonne. Il faut utiliser la formule : (quantité totale récuperée / quantité initiale )*100. Or il me faut la quantité initiale du coup !

    ...Bref si qqun peut m'aider à trouver la réponse au moins à la première question ca m'aiderai beaucoup!

    -----


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  3. #2
    dams7325

    Re : [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    Bonsoir,
    Tu sais que tu as 12.5mg de thyroglobuline pour 1ml de solution du coup tu fait un produit en croix pour les 200µL en convertissant les 1mL en 10^6 µL tu trouves 2.5mg pour 200µL de solution. Tu fais pareil avec les deux autres composés (je ne m'avance pas mais je pense qu'il faut procéder comme ça). Par contre je pense que la quantité c'est plus de la quantité de matière d'ailleurs ton rendement doit faire intervenir les quantités de matière et non la masse!!! Si tu connais la masse molaire de tes composés (en g.mol-1) tu peux facilement calculer cette quantité de matière (n = m/M). (1 Da correspondant à 1g/mol : à vérifier quand même).

  4. #3
    OffspringFan

    Re : [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    Oui j'avais fait ce calcul donc en convertissant en µL tout ca et justement j'étais coincée parce que je ne faisais pas intervenir les protéines.
    J'ai recopié la question telle quelle et il est bien mentionné la masse...
    Donc je me retrouve avec 2,5mg de thyroglobuline ; 1mg de cytochrome c ; 0,5mg de dichromate de potassium. Je suis partie avec ces bases là (et ca me rassure que je ne suis pas la seule à avoir procédée comme ca ^^).
    Les seules infos que j'ai donc pour le cytochrome c c'est donc sa masse moléculaire de 12400g/mol (1Da est bien égal à 1g/mol ^^) et donc mon 1mg de cytochrome c initial.
    Du coup je dois trouver la quantité de matière (en mol) initiale c'est ça? Parce que pour trouver la quantité de protéines dans 1mg de cytochrome c..
    Mais je me posais une autre question aussi...les daltons sont en g/mol mais en g de quoi? x)


  5. #4
    dams7325

    Re : [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    Bonjour,
    Le but du TP si j'ai bien compris est de voir ton rendement de cytochrome c par rapport à la quantité théorique initiale, du coup il faut que tu calcules la quantité (en mol) du cytochrome c que tu as récupéré. Mais après je ne vois plus trop comment faire =/ je sais que tu as un volume d'élution à déterminer avec un calcul faisant intervenir le volume mort (volume de la première molécule que tu as élué)...

  6. #5
    OffspringFan

    Re : [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    On ne peut pas garder des mg? Parce que grâce à la gamme étalon du cytochrome c, je peux voir l'absorbance en fonction de la quantité en mg de cytochrome c.

    Mais là je crois que j'ai un autre problème...qui vient probablement des mesures effectuées ! si à la base on a 1mg de cytochrome c on devrait en récupérer moins, au mieux 1mg...or j'en récupère 1,4 mg oO Je me demande si ça vient pas de la gamme étalon parce que je comprends pas pourquoi ils nous donnent une solution mère de 0,5mg/mL si on a dans notre mélange de base du cytochrome c à 5mg/mL...il ne faut pas diviser ou multiplier par un coefficient ?

    (Pour la gamme étalon du cytochrome : solution-mère de 0,5mg/mL, on doit diluer 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ;0,4 ;0,5; 0,6 ;0,8 ; 1mL de cette solution-mère en remplissant ce qu'il reste de la cuve (qui fait 2mL) avec du tampon d'élution. Mais pour tracer cette courbe il nous faut d'abord convertir les doses à diluer en mg ce qui donne du 0,05mg ; 0,1mg...etc étant donné que notre concentration massique est plus importante, ca change pas qqch?)

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    dams7325

    Re : [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    Bonjour,
    Eh bien puisque tu as les mg tu peux déterminer la quantité de matière (un rendement avec la masse ne sert à rien je te l'assure ^^). Après si tu as plus que prévu c'est peut parce que tu as récupéré un autre produit (le cytochrome c doit être élué en second non? donc entre deux autres produit) tout est possible erreurs de manipulation ect...Mais il ne faut surtout pas dire que tu as plus (+) de cytochrome c.
    Ta gamme étalon c'est l'absorbance en fonction de la masse? Donc avec l'absorbance de ton tube tu détermines la masse de ton cytochrome c que tu divises par la masse moléculaire de ton cytochrome c si évidemment on considère que la masse moléculaire théorique est égale à celle expérimentale (j'avais un TP dans le même genre où il fallait déterminer cette masse moléculaire en Da le problème c'est qu'elle varie pas mal en fonction des manips, du matériel, des méthodes utilisées ect...Tu n'as pas de courbe de Gauss à tracer? Si non tu n'a pas de masse moléculaire à déterminer donc tu divises m du cytc en g par 12400 tu fais pareil avec le théorique et tu divises la quantité expérimentale sur celle théorique tu multiplies par 100 et tu as ton rendement =). Là il sera forcément supérieur à 100 (mth < mexp).

  9. #7
    OffspringFan

    Re : [TP Séparation de molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne] Niveau L1S1

    Bon ben j'ai refais les calculs tout ça avec le nombre de daltons etc...et j'obtiens bien un rendement supérieur à 100 x) Ce qui me rassure s'il s'avère que c'est bon en fait x) donc TP rendu et encore merci pour ton aide, sans toi je serai encore en galère Merci !
    Bonne journée

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