Bonjour à tous,
Je dois réaliser pour mardi le compte-rendu de mon tp sur la séparation des molécules par chromatographie d'exclusion sur colonne mais je me retrouve bloquée aux questions de chimie...
Le principe est simple : on dispose d'une colonne à l'intérieur de laquelle on place un gel (Sephadex G50) qui va permettre de séparer différents constituants selon leur taille (rayon de Stokes). On cherche à séparer deux protéines (la thyroglobuline -->protéine incolore de 669000 daltons et le cytochrome c --> protéine porteuse d'un hème coordiné à un atome de Fer qui lui donne sa couleur rouge de 12400 daltons) et un sel (le dichromate de potassium --> sel de couleur jaune de 294 daltons). Le but du TP est de séparer ces trois constituants, détecter les molécules, doser les protéines et le cytochrome c.
Ces 3 constituants se trouvent en solution dans 200micro litres de tampon d'élution [Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5 ; NaCl 0,3 mol/L ; thimerozal 0,005% (antibactérien)] et il est noté : - thyroglobuline 12,5 mg/mL
- cytochrome c 5 mg/mL
- dichromate de potassium 2,5 mg/mL
La première manip consiste à déposer ces 200micro litres au dessus du gel et de rajouter par dessus du tampon d'élution tout en récoltant par le bas de la colonne des fractions de 2mL pour les deux premières et 1mL pour le reste (jusqu'à 17 fractions). On a alors comme résultat : un produit rouge de la 4ème à la 11ème fraction et jaune de la 12ème à la 16ème fraction.
Les deux et troisième manip du TP consistent à établir la gamme étalon du cytochrome c par dilution d'une solution-mère à 0,5mg/mL dans différents volumes et mesure d'absorption à 408nm ainsi que la gamme étalon pour le dosage des protéines grâce à une solution de BSA (albumine sérique de boeuf) à 1mg/mL avec du bleu de coomassie (méthode de Marion S. Bradford).
La manip suivante consiste à mesurer l'absorbance de nos fractions contenant le cytochrome c (rouge) et celles contenant le dichromate de potassium (jaune). Grâce à la gamme étalon du cytochrome c, on a pu obtenir la quantité de cytochrome c de nos fractions, en mg.
On a ensuite dû prélever 20micro litres des fractions 1 à 11 (la dernière contenant les dernières molécules de cytochrome c) et d'y rajouter 1mL de bleu de Coomassie permettant de mettre en évidence la présence des protéines. Avec la gamme étalon du BSA, on a pu obtenir la quantité de protéine pour ces fractions, en micro g.
Voilà pour l'aspect pratique du TP mais place aux questions !
- Première : Calculer la quantité (masse) de chacun des produits déposés sur la colonne (présent dans le mélange initial). Je comprend qu'il faut calculer la masse de cytochrome c, dichromate de potassium et thyroglobuline présents dans les 200micro litres de tampon d'élution du début mais ce que je ne comprend pas c'est cmt y parvenir ? J'essaie de m'aider des indications 5mg/mL, 2,5mg/mL...mais ca ne me donne rien de concluant. Je ne vois pas quoi utiliser comme formule ni même comme donnée. Ce qui me bloque par la suite.
- Deuxième question : Calculer le rendement de purification du cytochrome c après passage dans la colonne. Il faut utiliser la formule : (quantité totale récuperée / quantité initiale )*100. Or il me faut la quantité initiale du coup !
...Bref si qqun peut m'aider à trouver la réponse au moins à la première question ca m'aiderai beaucoup!
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si à la base on a 1mg de cytochrome c on devrait en récupérer moins, au mieux 1mg...or j'en récupère 1,4 mg oO Je me demande si ça vient pas de la gamme étalon parce que je comprends pas pourquoi ils nous donnent une solution mère de 0,5mg/mL si on a dans notre mélange de base du cytochrome c à 5mg/mL...il ne faut pas diviser ou multiplier par un coefficient ?
Merci !