Bonjour,
J'essaye de faire un exercice mais je butte sur les mêmes problèmes de toutes les façons sur les questions 3, 4 et 5. Je vous envoie les schémas que j'ai réalisé et l'énoncé pour que ce soit plus claire.
Problèmes:
- Je n'arrive pas à trouver les ARNm et protéines attendus pour la question 3. En effet les plasmides n'ont pas les séquences 5' UTR du gène de la luciférase. Dans ma réflexion, il ne reste plus que les séquences UTR en 5' du gène Tatou et en 3' du gène de la luciférase. Comme le transcrit est coupé en aval de cette séquence, je m'attends à avoir un ARNm qui contient le bout de gène tatou et le gene de la luciférase en plus de la séquence entre ces 2 gènes? Et cela pour toutes les constructions? Et ça me donnerait une protéine luciférase bizarre après la traduction, non?
- Question 4: Tous les ARNm produits par ces constructions 24h après la transfection sont isolés. Après hybridation avec une sonde radiomarquée constituée par la séquence complémentaire de l'ARNm complet du gène codant la luciférase (est ce que ça veut dire que la séquence de l'ARNm a encore ses introns et ses exons? donc avant épissage?), je m'attends à ce que cette sonde se soit hybridée avec le gène de la luciférase excepté la séquence 5' UTR qui n'est pas comprise dans le plasmide (pour moi elle flotte). Le traitement à la RNase va dégrader tous les ARN simple brin donc le reste de la séquence ARN qui ne correspond pas au transcrit du gène de la luciférase et la séquence complémentaire de la séquence UTR en 5' de la sonde. Ensuite on fait une électrophorèse sur gel dénaturant ce qui fait qu'on observe au final que la sonde radiomarquée plus ou moins grignotée par la luciférase.
On observe une bande d'épaisseur différente au même niveau pour chaque construction. Le fait que les bandes soient au même niveau montre que la sonde s'est hybridée à la même séquence d'ARNm et le fait que ces bandes soient de taille inférieure à celle de la sonde luciférase montre que la sonde a bien été grignotée par la RNase. L'épaisseur des bandes est relative à la quantité de radioactivité observée. Plus la bande est épaisse, plus les sondes ont été préservées de la RNase par hybridation et plus la quantité initiale d'ARNm était importante. On observe donc à travers cette expérience l'activité transcriptionelle associée à ces constructions.
En mettant en relation l'épaisseur des bandes et la construction analysée, on peut donc émettre les hypothèses suivantes (et c'est la que ça ne fait pas de sens pour moi):
- La construction 3 est faiblement transcrite. En la comparant à l'expression obervée pour la construction 1 ou témoin, il semblerait que la délétion dans l'intrant du gène Tatou influence la transcription du gène de la luciférase en la réduisant.
- Les constructions 1 et 4 sont moyennement transcrite. Comme la construction 1 est la construction témoin sans délétion, il semblerait que la délétion d'une partie de l'exon 1 du gène Tatou n'est pas d'effet sur la transcription de la construction.
- la construction 2 est la construction la plus transcrite. En la comparant avec l'expression de la construction 1 ou témoin, il semblerait que la délétion dans les 1000 bases soient à l'origine d'une augmentation de la transcription de la construction 2.
Cela ne fait aucun sens pour moi, parce qu'un intron ne régule pas la transcription! je ne comprends PAS PAS PAS.
Les dernières questions je n'ai pas besoin d'aide. Merci d'avance pour l'aide!
Bonne journée
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