La transgenèse bactérienne

[LoletteRose]

Bonsoir à tous !

J'ai un TP de biologie que je devais faire en groupe mais bon y'en a toujours un/une qui travaille pour les autres

Voici le protocole de l'expérience.

1) Ajouter 8 µl d’ADN dans le tube marqué +.
2) Mettre le tube marqué + et le tube marqué - sur la glace pendant 15 minutes.
3) Incuber les tubes deux minutes à 42°C (choc thermique)
4) Replacer les tubes dans la glace pendant 5 minutes.
5) Ajouter 1 ml de LB et incuber la suspension à 37°C pendant 30 minutes (pour l’expression de la
résistance à l’ampicilline).
6) Déposer et étaler:
0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp
0.1 ml du tube + sur une boîte LA
0.1 ml du tube – sur une boîte LA+ Amp,
0.1 ml du tube – sur une boîte LA
7) Centrifuger le reste de la suspension 30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les
cellules.
8)Enlever 0.7 ml de surnageant et le jeter.
9) Resuspendre le culot avec le reste (~ 0.1 ml) du surnageant
10) Déposer et étaler ces 0.1 ml sur une boite LA+Amp.
11) Mettre les boîtes à 37°C pendant 24 h. Les boîtes peuvent ensuite être gardées au frigo (4°C) et
incubées la nuit à 37°C avant de les observer en classe



Ma question est la suivante :

Je n'ai pas très bien compris le point 5). On ajoute 1ml de LB dans tous les tubes, dans le tube + ou alors c'est à part ?

Je me pose la question car au point 10) on ne demande d'étaler les 0.1 qui reste sur une boite LA+Amp. Et donc je ne sais pas d'ou provient le LB (d'un tube + ? )

Merci de votre aide !
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[Zellus]

Bonsoir,

Je n'ai pas très bien compris le point 5). On ajoute 1ml de LB dans tous les tubes, dans le tube + ou alors c'est à part ?

Tu ajoutes 1 mL de LB dans chacun des deux tubes (+ et -).
Cette étape 5 permet, comme c'est indiqué, de laisser le temps à tes bactéries de produire la protéine de résistance à l'ampicilline. Si tu étales tes bactéries sur boîte juste après l'étape 4, elles n'auront aucun moyen pour se défendre contre l'antibiotique les pauvres.
Dans ton tube -, bien sûr, ça change pas grand chose mais pour être rigoureux et se retrouver dans les mêmes conditions, on ajoute aussi le LB et on incube à 37°C 30 minutes. Leur funeste destin est tout tracé ...

Je me pose la question car au point 10) on ne demande d'étaler les 0.1 qui reste sur une boite LA+Amp. Et donc je ne sais pas d'ou provient le LB (d'un tube + ? )

Non, c'est écrit à l'étape 9. Après avoir étalé 0,2 mL de tes bactéries à l'étape 6 (2 fois 0,1 mL pour le tube + et 2 fois 0,1 mL pour le -, vu que tu as deux boîtes, une avec et une sans ampicilline), il te reste donc environ 0,8 mL de suspension bactérienne que tu centrifuges.
Tu vires alors 0,7 mL de ton surnageant et il te reste environ 0,1 mL dans lequel tu resuspends tes bactéries. Tu travailles donc toujours dans tes deux tubes (+ et -) de départ. Tu étales alors les 0,1 mL sur de nouvelles boîtes avec ampicilline, ce qui te permettra de voir qu'en déposant 10 fois plus de bactéries du tube + (8 fois plus pour être précis plutôt), tu as sur ta boîte environ 10 fois plus de bactéries résistantes. Et toujours rien pour le tube -.

Voilà , j'espère avoir été assez clair. ^^