Bonjour à tous
Dans le but de mettre en évidence des différences dans l'expression de la Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (une protéine de réparation de l'ADN) chez des cellules soumises à différentes concentrations de drogue X, j'effectue des Western Blots.
Suite à quelques problèmes (impossible de mettre en évidence ladite protéine), j'ai décidé d'inclure une étape de sonication pour découper l'ADN des échantillons cellulaires.
Je monte la manip à partir d'un article qui n'est bien sur pas aussi précis qu'un protocole et qui présente qq incohérences (enfin je trouve).
Donc je souhaiterais savoir si ce qui suit tient la route ou s'il y a des erreurs et avoir des précisions quant à la sonication
Je suis OP pour tout conseil et suggestions pour améliorer la manip.
1/ Après récolte des échantillons cellulaires, effectuer 2 lavages des culots au PBS 1X contenant 1 mM de PMSF et 0,5 µg/mL des inhibiteurs de protéases suivants: aprotinine, antipain et leupeptine ( le tout glacial?) entrecoupés de centrifugation 800 x g /2 minutes/4°C.
2/ Après élimination des surnageants, re-suspendre les culots dans la même solution qu'à l'étape 1/ et centrifuger 1000 xg/15 minutes/4°C (long?!, vrmt utile?)
3/ Jeter les surnageants et reprendre le culots uniquement dans du sample buffer 1X (bouillant ou non?) soit: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 4M urée;10% glycérol;2% SDS; 5% B-Me ajouté au dernier moment; 0,003 % bleu de bromophénol (si peu?)
4/ Vortexer fortement puis soniquer les échantillons sur glace pendant 60 s, et alors là je n'ai pas compris comment déterminer les paramètres avec ce qui est dit dans l'article: "microtips at limit, 40% duty cycle"????? Je précise que je compte utiliser le Branson sonifier 150
5/ Chauffer les échantillons soniqués 15 minutes à 65°C puis les conserver à -20°C
ou bien:
Conserver directement après sonication, les échantillons à -20°C et ne les faire bouillir qu'avant de loader???
Il est aussi question dans l'article de bloquer le gel de migration (??????, jamais vu ça) avant le transfert sur membrane de nitrocellulose, qui est également bloquée après le transfert.
Je suis un peu perdue
D'avance, merci pour vos réponses :-S
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