Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

[invite7e055e83]

Bonjour à tous

Dans le but de mettre en évidence des différences dans l'expression de la Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (une protéine de réparation de l'ADN) chez des cellules soumises à différentes concentrations de drogue X, j'effectue des Western Blots.
Suite à quelques problèmes (impossible de mettre en évidence ladite protéine), j'ai décidé d'inclure une étape de sonication pour découper l'ADN des échantillons cellulaires.
Je monte la manip à partir d'un article qui n'est bien sur pas aussi précis qu'un protocole et qui présente qq incohérences (enfin je trouve).
Donc je souhaiterais savoir si ce qui suit tient la route ou s'il y a des erreurs et avoir des précisions quant à la sonication

Je suis OP pour tout conseil et suggestions pour améliorer la manip.

1/ Après récolte des échantillons cellulaires, effectuer 2 lavages des culots au PBS 1X contenant 1 mM de PMSF et 0,5 µg/mL des inhibiteurs de protéases suivants: aprotinine, antipain et leupeptine ( le tout glacial? ) entrecoupés de centrifugation 800 x g /2 minutes/4°C.

2/ Après élimination des surnageants, re-suspendre les culots dans la même solution qu'à l'étape 1/ et centrifuger 1000 xg/15 minutes/4°C (long?!, vrmt utile?)

3/ Jeter les surnageants et reprendre le culots uniquement dans du sample buffer 1X (bouillant ou non?) soit: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 4M urée;10% glycérol;2% SDS; 5% B-Me ajouté au dernier moment; 0,003 % bleu de bromophénol (si peu?)

4/ Vortexer fortement puis soniquer les échantillons sur glace pendant 60 s, et alors là je n'ai pas compris comment déterminer les paramètres avec ce qui est dit dans l'article: "microtips at limit, 40% duty cycle"????? Je précise que je compte utiliser le Branson sonifier 150

5/ Chauffer les échantillons soniqués 15 minutes à 65°C puis les conserver à -20°C
ou bien:
Conserver directement après sonication, les échantillons à -20°C et ne les faire bouillir qu'avant de loader???

Il est aussi question dans l'article de bloquer le gel de migration (??????, jamais vu ça) avant le transfert sur membrane de nitrocellulose, qui est également bloquée après le transfert.

Je suis un peu perdue



D'avance, merci pour vos réponses :-S
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[invitee4e79868]

Bonjour,

Je ne malheureusement pas répondre à toute les questions mais...
2) 15min, de centri, c'est long, surtout pour faire un culot => 5 min me parait plus adapté
3) non bouillant pour suspendre une solution (mauvais pour la pipette aussi ). Le bleu de bromophénol est facultatif, et ne doit permettre qu'à "voir" la solution, et vérifier que l'on a correctement chargé son gel.
4) pour la sonication, aucune idée. On avait un programme tout fait dans mon labo, et on n'ajustait rien du tout. Et tout marchait pour cette étape.
5) Il faut dénaturer les protéines en les chaffant avant de les déposer sur gel
Bloquer un gel ne se fait que rarement. Je ne l'ai fait que pour une manip, avec des toutes petites protéines...

Après, il faut également se rendre compte que tu gardes (et fait migrer) également les lipides de la membrane et l'ADN. Ca pollue et peut interagir.

J'ai trouvé un article qui peut (peut-être) aider :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/arti...00089-0246.pdf de 1991

[invite7e055e83]

Merci pour ta réponse!

Quand tu disais avoir bloqué ton gel une fois, pour des petites protéines, en terme de kDa ça donne quoi?

[invitee4e79868]

Entre 7 et 10kDa (ou 5?). Je ne me souviens plus très bien. Et je l'ai fait sous la direction d'un ancien du labo, donc je dois avoué que j'ai été assisté (ou l'assistant? ). Donc je ne pourrai pas t'aider sur ce genre de détails. Et puis de toute façon, ma manip' m'avait donné des résultats négatifs, qu'on attendait (on ne détectait déjà pas d'ARN, alors...).
Bon courage pour tes futurs manip'!

[A voir en vidéo sur Futura]