Bonjour,

Je m'entraîne pour un examen de microbiologie, voici l'énoncé:

Etablir les paramètres expérimentaux pour une double digestion complète de 4µg de plasmide pMD-GAI (5*Kpb*; solution à 500*ng/µl) par les enzymes de restriction EcoRI et PstI (toutes à 10u/µl). Vous remplirez le tableau de digestion ci-dessous et vous justifierez succinctement les volumes utilisés.

Vous digérerez l’ADN dans le volume réactionnel le plus petit permis.
Il est interdit de pipeter moins de 1µl.
Données*: ADN du phage lambda*: 50*Kbp*; 5 sites EcoRI*; 28 sites PstI. (+ photo du plasmide pMD-GAI pour les sites de restriction des deux enzymes).
D’après la charte du fabricant, les 2 enzymes de restriction fonctionnent à 100% dans le tampon "R2"1X.

Donc aucun problème pour calculer le volume de plasmide à digérer (8µL), le volume de chaque enzyme (théoriquement en dessous de 1µL mais nous utiliserons 1µL de chaque). Par contre je n'arrive pas vraiment à trouver le volume réactionnel final qui me permettrait de calculer le volume de tampon de digestion et d'eau stérile. La dernière phrase permet sûrement de le calculer car on sait que les deux enzymes fonctionnent à 100% si le tampon est dilué 1 fois. Ici on a un tampon 10X du coup il doit être dilué 10 fois pour que les enzymes aient une activité de 100%. Mais comment calculer le volume final alors qu'on pourrait simplement "choisir" n'importe quel volume comme 20µL par exemple (soit 20/10 = 2µL de tampon et donc 20-1-1-8-2 = 8µL d'eau stérile à rajouter).

Du coup est-ce qu'il y a un calcul de volume final à faire, ou faut-il juste fixer un volume final de sorte à ne pas pipetter des volumes d'eau et de tampon inférieur à 1µL et ne pas non plus exagérer sur le volume final?

Merci d'avance.