système de double hybride

[invite29055bb9]

SALUT

svp qui peut m'aide pour comprendre le système de double hybride ?

et merci d'avance
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[invitee4e79868]

Salut,

Je fais court => http://en.wikipedia.org/wiki/Two-hybrid_screening
En anglais. Car la page française est comment dire... Le néant?
J'ai survolé les références de l'article wiki. Elles me semblent très sérieuses, à lire pour plus de détails.

[invite29055bb9]

Merci beaucoup mon prof

je ne suis pas bien en anglais mais j'essayerai de le comprendre

merci

[invitee4e79868]

Si tu as des doutes, n'hésites pas à poser les questions techniques ici. On trouvera toujours quelqu'un pour répondre

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite29055bb9]

SALUT , j'ai quelque questions

- pourquoi la transcription ne se déroule sauf lorsque les deux protéines Bait et Prey se lient avec le facteur de transcription ?
- dans les deux cas A et D la transcription se déroule . Est-ce-que aprés chaque des deux transcriptions on obtient le meme B-galactosidase ?
- Est-ce-qu'il faut les deux domaines de Gal4 etre relier entre eux pour activer la transcription ?
- pourquoi cette technique s'appelle "système de double hybride" ?

et merci d'avance

[invitee4e79868]

pourquoi la transcription ne se déroule sauf lorsque les deux protéines Bait et Prey se lient avec le facteur de transcription ?

Pour permettre l'activation du promoteur du gène rapporteur (ici LacZ), il faut une interaction entre Gal4BD et Gal4AD.
La cas A, c'est le cas classique.
Dans les autres cas, Gal4BD et Gal4AD ont été modifié en fusionnant deux protéines différentes. Ces deux protéines sont des théoriquement capable d'interagir entre elles. Elle vont donc rapprocher les Gal4BD et Gal4AD ce qui va permettre l'activation du promoteur et le début de la transcription du gène.
Dans les cas B et C, il manque à chaque fois un des partenaires.
Dans le cas D, la protéine "appat" (Bait) fusionné à la Gal4BD "attrape" la protéine "proie" (Prey) fusionné à la Gal4AD. Ce rapprochement entre Gal4BD et Gal4AD permet la transcription du gène.

Est-ce-que aprés chaque des deux transcriptions on obtient le meme B-galactosidase ?

Oui. Ce mécanisme ne change pas la séquence d'ADN, et il s'agit du même gène

Est-ce-qu'il faut les deux domaines de Gal4 etre relier entre eux pour activer la transcription ?

Si je me souviens bien, ils n'ont pas besoin d'être relié physiquement. Mais ils doivent être très proche l'un de l'autre. Ce qui dans la cellule, qui est un environnement très dynamique, signifie accroché.

pourquoi cette technique s'appelle "système de double hybride" ?

Car il faut ajouter sur deux protéines d'intérêt (censé interagir entre elles) la séquence Gal4BD ou AD. Deux protéines hybrides
Cependant, lors d'un screening (qui sont de plus en plus rare), on garde le même appat, et l'on fait varier la proie.

Cette technique reste difficile à mettre en oeuvre car si Gal4 (BD ou AD) est mal positionné dans la protéine, il peut empêcher une interaction qui aurait eu lieu.

[invite29055bb9]

Je vous remercie bien pour vos réponses rapides

à partir de vos réponses je vais poser autre questions

La cas A, c'est le cas classique.
.

c-à-d le Gal4 se trouve dans tous les levures normale et naturelle pour activer la transcription n'est-ce-pas ?

Dans les autres cas, Gal4BD et Gal4AD ont été modifié en fusionnant deux protéines différentes.
.

c-à-d les Gal4BD et Gal4AD de premier cas se sont pas les memes Gal4BD et Gal4AD de les autre cas ?

Dans les cas B et C, il manque à chaque fois un des partenaires.
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un des partenaires c-à-d un des ( Gal4BD et Gal4AD ) ou un des (appat et proie)?

Dans le cas D, la protéine "appat" (Bait) fusionné à la Gal4BD "attrape" la protéine "proie" (Prey) fusionné à la Gal4AD. Ce rapprochement entre Gal4BD et Gal4AD permet la transcription du gène.
.

c-à-d le déroulement de la trancription exige l'existance des deux domaines de Gal4 soit seulement comme le premier cas soit entre les 2 domaines il y a deux protéines peuvent interagir entre eux n'est ce pas ?

les deux domaines n'ont pas besoin d'être relié physiquement. Mais ils doivent être très proche l'un de l'autre

est-ce-qu'il est peut etre malgré l'existance des deux domaines de Gal4 mais la transcription ne déroule pas parce qu'ils son loin l'un de l'autre ?

quel est le résultat s'il existe sauf les deux protéines appat et proie ?
quel est le résultat s'il y a entre les deux domaines de Gal4 soit appat soit proie ?


si on dit " individu hybride" c-à-d les deux allèles de n'importe gène se sont pas identiques n'est-ce-pas?
donc que veut dite " protéine hybride"
car je ne comprends

Car il faut ajouter sur deux protéines d'intérêt (censé interagir entre elles) la séquence Gal4BD ou AD. Deux protéines hybrides
Cependant, lors d'un screening (qui sont de plus en plus rare), on garde le même appat, et l'on fait varier la proie.
.

et merci d'avance pour vos réponses

[invitee4e79868]

Oula, tout cela ne semble pas clair pour toi...

Alors, dans l'ordre. Dans une levure classique, les gènes GAL4 sont normalement présent. Mais dans la levure qui est utilisé, les gènes codant pour les protéines GAL4 sont apportées par un/des plasmide(s). Le gène rapporteur est normalement déjà présent, mais il peut également être apporté.
Donc, le promoteur du gène rapporteur est activé par l'interaction (ou le rapprochement) des deux protéines GAL4. Ce qui permet l'expression du gène rapporteur (et sa visualisation). Ca, c'est la cas classique. Le truc, c'est que l'on ne peut pas s'en servir en l'état.

Les protéines hybrides sont des protéines qui comportent au minimum deux séquences protéiques d'origine différentes. Dans notre cas, un des GAL4 de la levure va être fusionné à une protéine humaine. On obtient alors une protéine chimère, que l'on ne trouvera pas dans la Nature.

Je vais fonctionner avec un exemple (imaginaire)
On a deux protéines d’intérêt humaine, PCR-1 (appat) et AST-1 (proie) que l'on étudie au laboratoire. On a leur séquence ADN (ADNc) sur un plasmide. Et on pense qu'il y a interaction de ces deux protéines dans la cellule humaine (colocalisation). On veut donc vérifier s'il y a réellement une interaction direct entre ces deux protéines, et pour cela on utilise les système double hybride.
A coups d'ingénierie génétique (du clonage, simplement), on va fusionner la séquence ADN de GAL4BD à celle de PCR-1, pour que ces deux protéines n'en forme plus qu'une seule. On procède de même avec AST-1 et GAL4AD. On a donc la séquence de deux protéines chimères. Vu que l'on est très sérieuc au laboratoire, on effectue une série de contrôle en même temps que le test principal. Ces contrôles ont pour objectif de vérifier que notre gène rapporteur ne s'exprime que lorsqu'il y a interaction entre les deux activateurs de GAL4.
Pour le contrôle positif, on fait comme dans le cas A, c'est à dire les protéines natives de la levure, afin de vérifier que tout fonctionne bien. Puis deux contrôle négative, B et C, qui permette de vérifier si la fusion PCR-1-GAL4BD et AST-1-GAL4AD sont incapable d'activer le gène rapporteur lorsqu'ils sont seuls.
Pour le test en lui même, on met nos deux protéines chimères ensembles, on attends qu'elles soient exprimées par la levure, puis qu'elles interagissent entre elles (ou pas). S'il y a interaction entre PCR-1 et AST-1, les deux protéines GAL4 seront alors assez proche pour activer la transcription du gène rapporteur. Et on pourra donc visualiser cette interaction facilement.

Voilà, en espérant avoir été plus clair...

[invite29055bb9]

merciiiiiiiiiiiii mon prof pour la détaillée explication

OUI j'ai compris et je peux connaitre les réponses de quelques mes questions parmi elles :
un des partenaires c-à-d un des ( Gal4BD et Gal4AD ) ou un des (appat et proie)? la réponse est : un des partenaires c-à-d un des protéines chimères n'est-ce-pas ?

protéine hybride = protéine chimère n'est-ce-pas ?

autre question SVP . de quoi s'agit il levure classique et levure qui est utilisé ?

et merci

[invitee4e79868]

Ouf, c'est fois-ci, il semble que tu ais compris
Il est généralement utilisé Saccharomyces cerevisiae, la levure la plus utilisé dans la recherche http://fr.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae

[invite29055bb9]

Merci mon prof

et voilà cette fleur comme un petit cadeau

merci autre fois pour vos aides