Protocole technique de double hybride (Yeast two-Hybrid)

[invite537c5180]

Bonjour,
Pour l´étude de l´interaction entre deux protéines bactériennes, je réalise en ce moment des expériences de double hybride (Yeast two-Hybrid), enfin j´essaye . Une technique qui n´est pas utilisée dans mon labo en ce moment (enfin, pas depuis très longtemps), donc personne pour me conseiller . Je me tourne donc vers vous, afin de savoir si l´un d´entre vous, aurait déjà eu l´occasion de faire des expériences de Y2H (ou connaitrait quelqu´un qui en fait), et aurait l´extrême gentillesse de me passer un petit protocole qui marche , j´utilise la souche AH109 (la souche la plus communément utilisée pour ce type d´expériences, je pense). Mon problème est que je n´arrive pas à obtenir de colonies bleues en milieu minimum sans Tryptophane et Leucine, ni même de colonies tout court , donc j´ai un peu de doutes sur ce protocole du moyen age qu´on m´a donné .
Merciiiiiiiiiiii d´avance.
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[invitefb4af953]

Sort nous les grandes lignes de ton protocols il y a peut-être des étapes où tu fais n'imp'.

[invite537c5180]

Bonjour, voici le protocol que j´utilise (je m´excuse, c´est en anglais ), mon probleme c´est que j´obtient tres peu de colonies (blanches bien sur) et seulement dans le milieu SD avec Trp et Leu, et parfois pour le milieu SD avec Trp et sans Leu.

Stock solution :
SorB: 100 mM lithium acetate + 10 mM Tris-Hcl (pH 8.0) + 1 mM EDTA (pH 8.0) + 1 M sorbitol, adjusted with acetic acid to pH 8,0.
Carrier DNA: 10 mg/ml salmon sperm DNA (Invitrogen) denaturated at 100ºC for 10 min and cooled on ice.
PEG: 100 mM lithium acetate + 10 mM Tris-Hcl (pH 8,0) + 1 mM EDTA (pH 8.0) + 40% PEG3350.
Day 1: Pre-culture
1- Grow Saccharomyces cerevisiae AH109 O/N in 25 ml of YPAD, 30ºC, shaking 200 rpm.
Day 2: Preparation of competent cells (cells kept at RT)
2- Inoculate 50 ml of YPAD with the O/N culture (intial OD600nm 0,1).
3- Grow at 30ºC, shaking 200 rpm to OD600nm 0,5-0,6 (it should take between 4 and 6h).
4- Centrifuge in 50 ml Falcon tubes (3 min / 2000 rpm or 500 g), discard supernatant.
5- Wash cells with 15 ml sterile H2O, centrifuge (3 min / 2000 rpm or 500 g), discard supernatant.
6- Wash cells with 10 ml SorB, centrifuge (3 min / 2000 rpm or 500 g), discard supernatant.
7- Dissolve cells in 360 µl of SorB and add 40 µl carrier DNA.
8- In nine 1,5 ml µtubes put: 12 µl of these competent cells and 1 µl of each plasmid (see the combinations), mix by flicking.
Plasmids :
pDK20 N-terminal fusion of proteinX to GAL4-AD
pDK21 N-terminal fusion of proteinX to GAL4-BD
pDK22 N-terminal fusion of proteinY to GAL4-AD
pDK26 N-terminal fusion of proteinY to GAL4-BD
→ pGADT7 contain the transcriptional activation domain GAL4-AD (Leucin marker).
→ pGBKT7 contain the DNA binding domain GAL4 DNA-BD (Tryptophan marker).
Combinations:
pDK20 + pDK21 / pDK22 + pDK26 / pDK20 + pDK26 / pDK21 + pDK22/ pDK20 alone/ pDK21 alone / pDK22 alone / pDK26 alone / without plasmids.
9- Add 6-fold volume of sterile PEG, mix by flicking.
10- Incubate 30 min at 30ºC.
11- Heat shock 15 min at 42ºC (waterbath).
12- Centrifuge 3 min / 2000 rpm or 500 g, suck off supernant.
13- Wash cells once with 1 ml YPAD, centrifuge 3 min / 2000 rpm or 500 g, discard the supernant.
14- Resuspend cells in 1 ml YPAD.
15- Incubate in a shaker (200 rpm) for 4-6 h at 30ºC.
16- Spread 2,5µl, and 100µl on plates.
Plate on + X-Gal (80 µg/ml)
Selects for Phenotype
SD-medium - White
SD-medium - Trp pGBKT7 White
SD-medium - Leu pGADT7 White
SD-medium - Leu - Trp pGADT7 and pGBKT7 Blue

[invitefb4af953]

A mon avis c'est fort probable que se soit ta transformation qui marche pas.
T'es plasmid on un gene de sélection vis à vis de ton milieu de culture n'est ce pas ? si ta pas de bactérie c'est qu'elles l'ont pas probablement.

Généralement j'aime pas utilisé le choc thermique pour la transfo c'est trop aléatoire. Essaye de faire t'es transfo par électroporation tu sera au moins sûr que cette étape marche.
Aussi ta déterminer la concentration de tes plasmids avant la transfo ? par ce que on transforme pas avec des µl de plasmid sinon une quantité. Il faudrait que tu utilise 100ng au moins pour être sûr que ta transfo marche.

Après je sais pas, mais si tu as aucune bactérie c'est surement la transfo qui marche pas.

Bonne chance!

P;S: "suck off the supernatant" : vive le bilinguisme de la france X)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite537c5180]

Oui,
Les plasmides pDK20 et 26 comportent le domaine d´activation transcriptionnel GAL4-AD (gène de synthèse de la Leucine).
Et les plasmides pDK21 et 22 comportent le domaine de liaison à l´ADN GAL4 DNA-BD (gène de synthèse du Tryptophane).

Mes 4 plasmides sont tous à une concentration de près de 300 ng/µl.

Ok, je vais essayer l´electroporation. Merci JakiJake !