Yeast Two Hybrid System

[invite537c5180]

Bonjour,
Pour l´étude de l´interaction entre deux protéines bactériennes, j´aimerai réaliser des expériences de double hybride en levure (Y2H). Mon probléme, c´est que j´ai des difficultés a faire pousser mes cellules (Saccharomyces cerevisiae AH109) sur milieu solide YPAD, je n´arrive a obtenir que de miniscules colonies (des points) aprés 4 jours, je pense donc que ce sont des contaminants. Pour info, les cellules poussent trés bien sur milieu liquide, aussi bien en milieu YPAD qu´en milieu minimum Dropout, j´arrive a obtenir une DO de 1 en 8h pour le milieu YPAD. Alors ma question est toute simple, combien de temps faut-il généralement attendre pour obtenir des colonies de Saccharomyces cerevisiae sur milieu YPAD ? Merci d´avance
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[invite537c5180]

Ah, j´oublias, mes boites sont dans un incubateur à 28ºC et non 30ºC, est-ce que cela peut vraiment ralentir considérablement la croissance des bactéries !?
Merci

[invitefb4af953]

Salut!
Déjà t'es sûr que en milieu liquide c'est pas une contamination qui pousse ?

Est ce que ta culture est soumise à une pression de selection ? URA3 par exemple j'imagine.

BOn j'y connais rien aux levures et pas trop aux systemes hybrides, mais j'imagine que tu peux aussi bien faire le 2hybrid system dans milieu liquide non ? tu design le truc pour que l'intéraction des 2 protéine lève la répression d'une promoteur qui controle un gene de resistance ou truc du genre.

Bon après ceci dit essaye d'abord de débeuger ton expérience. Les gélose c'est toi qui les coule ? sinon check bien auprès des laborantin(e) si tu te trompe pas de gélose qui aurait un antibio ou je sais pas quoi dedans.
Ensuite, j'ai jamais fait, mais j'imagine que pour faire ça ta transformé tes levures avec un plasmide avant d'étaler sur boite ? Si c'est le cas pense bien à la régénération des cellules après transfo avant d'étaler sur milieu sélectif. Pour la transfo en elle même, diminue le volume de cellules par rapport au volume d'ADN. Et si c'était par choc thermique, fait le par electroporation.

Et sinon, 28 ou 37°C aucune importance. Se sera plus long à 28°C mais une culture 24h devrait suffire même pour des levures je pense.

espérant t'avoir donné des idées,

[invite537c5180]

Merci pour ton message JakiJake. Je viens de faire un état frais, et en faite ma culture est contaminée , il n y a que des bacilles. Je vais relancer une culture á partir du stock á -80 qu´on a au labo, j´espére que ce n´est pas le stock qui est contaminé .
Sinon ce sont des cellules WT, que je souhaiterai co-transformer si j´arrive á les faire pousser sur boites ; et les milieux c´est moi qui les coulent, je vais en recouler d´autres pour être sûr.

[A voir en vidéo sur Futura]