pH d'une solution protéique et Western-blot

[jessica28]

Bonjour,
après avoir réalisée une extraction protéique, j'ai repris mon culot (pas ou peu visible selon les échantillons) dans du Laemmli 1X+bétamercaptoéthanol. Après vortex, il s'est avéré que ma solution protéique est devenue jaune signifiant que mon échantillon était à un pH de 3 environ. Si je fais migrer cette solution acide dans mon gel de Western-blot, est ce que cela aura un impact sur la migration? Le pH change la conformation des protéines mais est ce que cette dénaturation (?) aura un impact sur la migration/transfert et/ou révélation?
Si je mets un peu de soude pour rendre plus basiques mes solutions protéiques (pH 6-7 environ), est ce que ce sera mieux ou pire ou sans effet?
Ca fait beaucoup de question... Merci d'avance de me répondre.
Cordialement
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[noir_ecaille]

A priori, même si je n'ai jamais pratiqué la technique, un pH si bas me semble problématique et peut causer la dénaturation des immunoglobuline.

Il me semblerait opportun de le rééquilibrer.

[seb--72]

Tu peux toujours tester ce que ça donne sur ton gel et sur ta membrane pour ton W-B.
J'en lancé un native page y a deux semaines et ma solution était tendance verte et non bleue. ça a fonctionné.

[jessica28]

Merci beaucoup pour vos réponses !
J'ai déposé mes solutions "acides" dans mon gel de polyacrylamide et la migration s'est déroulée beaucoup plus rapidement et le front de migration au départ était déformé. Après révélation, je n'ai rien obtenu.
J'ai retenté en mettant de la soude 2N (Cf=0,1M) et là j'ai obtenu mes bandes attendues mais il semble que ma protéine se soit dégradée car j'ai aussi des bandes à un poids moléculaire plus faible...

[A voir en vidéo sur Futura]

[Pfhoryan]

Merci beaucoup pour vos réponses !
J'ai déposé mes solutions "acides" dans mon gel de polyacrylamide et la migration s'est déroulée beaucoup plus rapidement et le front de migration au départ était déformé. Après révélation, je n'ai rien obtenu.

Pas étonnant, si c'est un Laemmli (conditions dénaturantes) c'est le SDS qui forme des patchs sur la protéine et la fait migrer. Et si le pH est trop acide, la charge peut ne pas être suffisamment négative pour obtenir une bonne migration.

J'ai retenté en mettant de la soude 2N (Cf=0,1M) et là j'ai obtenu mes bandes attendues mais il semble que ma protéine se soit dégradée car j'ai aussi des bandes à un poids moléculaire plus faible...

C'est ce qu'il fallait faire. Si vous avez des bandes supplémentaires, c'est soit que votre protéine n'est pas pure, soit qu'elle a été dégradée avant l'analyse sur gel.