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pH d'une solution protéique et Western-blot



  1. #1
    jessica28

    pH d'une solution protéique et Western-blot

    Bonjour,
    après avoir réalisée une extraction protéique, j'ai repris mon culot (pas ou peu visible selon les échantillons) dans du Laemmli 1X+bétamercaptoéthanol. Après vortex, il s'est avéré que ma solution protéique est devenue jaune signifiant que mon échantillon était à un pH de 3 environ. Si je fais migrer cette solution acide dans mon gel de Western-blot, est ce que cela aura un impact sur la migration? Le pH change la conformation des protéines mais est ce que cette dénaturation (?) aura un impact sur la migration/transfert et/ou révélation?
    Si je mets un peu de soude pour rendre plus basiques mes solutions protéiques (pH 6-7 environ), est ce que ce sera mieux ou pire ou sans effet?
    Ca fait beaucoup de question... Merci d'avance de me répondre.
    Cordialement

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    noir_ecaille

    Re : pH d'une solution protéique et Western-blot

    A priori, même si je n'ai jamais pratiqué la technique, un pH si bas me semble problématique et peut causer la dénaturation des immunoglobuline.

    Il me semblerait opportun de le rééquilibrer.
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  4. #3
    seb--72

    Re : pH d'une solution protéique et Western-blot

    Tu peux toujours tester ce que ça donne sur ton gel et sur ta membrane pour ton W-B.
    J'en lancé un native page y a deux semaines et ma solution était tendance verte et non bleue. ça a fonctionné.

  5. #4
    jessica28

    Re : pH d'une solution protéique et Western-blot

    Merci beaucoup pour vos réponses !
    J'ai déposé mes solutions "acides" dans mon gel de polyacrylamide et la migration s'est déroulée beaucoup plus rapidement et le front de migration au départ était déformé. Après révélation, je n'ai rien obtenu.
    J'ai retenté en mettant de la soude 2N (Cf=0,1M) et là j'ai obtenu mes bandes attendues mais il semble que ma protéine se soit dégradée car j'ai aussi des bandes à un poids moléculaire plus faible...

  6. #5
    Pfhoryan

    Re : pH d'une solution protéique et Western-blot

    Citation Envoyé par jessica28 Voir le message
    Merci beaucoup pour vos réponses !
    J'ai déposé mes solutions "acides" dans mon gel de polyacrylamide et la migration s'est déroulée beaucoup plus rapidement et le front de migration au départ était déformé. Après révélation, je n'ai rien obtenu.
    Pas étonnant, si c'est un Laemmli (conditions dénaturantes) c'est le SDS qui forme des patchs sur la protéine et la fait migrer. Et si le pH est trop acide, la charge peut ne pas être suffisamment négative pour obtenir une bonne migration.

    Citation Envoyé par jessica28 Voir le message
    J'ai retenté en mettant de la soude 2N (Cf=0,1M) et là j'ai obtenu mes bandes attendues mais il semble que ma protéine se soit dégradée car j'ai aussi des bandes à un poids moléculaire plus faible...
    C'est ce qu'il fallait faire. Si vous avez des bandes supplémentaires, c'est soit que votre protéine n'est pas pure, soit qu'elle a été dégradée avant l'analyse sur gel.
    “if something happened it’s probably possible.” Peter Coney

  7. A voir en vidéo sur Futura

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