Thermodénaturation de l'ADH, problème de compréhension d'un protocole

[Meiosis]

Bonsoir,

Je dispose d'une expérience au cours de laquelle l'alcool déshydrogénase est dénaturée thermiquement (75°C à différents temps au lieu des 30°C optimum). Voici l'expérience :

A) Thermodénaturation de l'ADH en absence des substrats :

- Préparer 4 tubes à hémolyse contenant :
- Tampon glycine pH 8,8 1,00mL
- ADH 100U/mL 0,05mL
- Préparer un blanc pour chaque tube contenant de l'eau à la place de l'ADH
- Incuber chaque tube 0, 15, 30 et 60 minutes en bain thermostaté à 75°C
- Transférer les tubes à 30°C
- Ajouter dans les 4 tubes :
- éthanol 3 mol/L 0,05mL
- NAD+ 15 mmol/L 0,05mL
- Incuber 5 minutes précisément à 30°C
- Ajouter 1mL d'urée saturée à 75°C pour stopper la réaction
- Laisser refroidir
- Transvaser dans une cuve à spectrophotomètre
- Lire la densité optique à 340nm contre un blanc contenant de l'eau à la place de l'ADH

B) Thermodénaturation de l'ADH en présence des substrats :

- Préparer 4 tubes à hémolyse contenant :
- Tampon glycine pH 8,8 1,00mL
- ADH 100U/mL 0,05mL
- éthanol 3mol/L 0,05mL
- Préparer un blanc pour chaque tube contenant de l'eau à la place de l'ADH
- Incuber chaque tube 0, 15, 30 et 60 minutes en bain thermostaté à 75°C
- Transférer les tubes à 30°C
- Ajouter dans les 4 tubes :
- NAD+ 15 mmol/L 0,05mL
- Incuber 5 minutes précisément à 30°C
- Ajouter 1mL d'urée saturée à 75°C pour stopper la réaction
- Laisser refroidir
- Transvaser dans une cuve à spectrophotomètre
- Lire la densité optique à 340nm contre un blanc contenant de l'eau à la place de l'ADH


- Préparer 4 tubes à hémolyse contenant :
- Tampon glycine pH 8,8 1,00mL
- ADH 100U/mL 0,05mL
- NAD+ 15mmol/L 0,05mL
- Préparer un blanc pour chaque tube contenant de l'eau à la place de l'ADH
- Incuber chaque tube 0, 15, 30 et 60 minutes en bain thermostaté à 75°C
- Transférer les tubes à 30°C
- Ajouter dans les 4 tubes :
- éthanol 3mol/L 0,05mL
- Incuber 5 minutes précisément à 30°C
- Ajouter 1mL d'urée saturée à 75°C pour stopper la réaction
- Laisser refroidir
- Transvaser dans une cuve à spectrophotomètre
- Lire la densité optique à 340nm contre un blanc contenant de l'eau à la place de l'ADH

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Ma question c'est la suivante. Je n'ai tout simplement pas compris le déroulement des expériences. On dit qu'on dénature d'abord l'enzyme ADH sans substrats mais on demande quand même d'ajouter dans les 4 tubes les substrats, à savoir l'éthanol et le NAD+...
Ensuite en B) dénaturation en présence de substrats la manipulation est exactement la même sauf qu'on met d'abord de l'éthanol puis du NAD+ et dans le troisième cas d'abord du NAD+ puis après de l'éthanol, c'est censé changer quoi ?

En gros je ne comprends pas cette histoire de présence/absence de substrats puisque dans les deux cas il y a les substrats ! Après l'ordre d'introduction des produits je ne vois pas non plus ce que ça change, je ne peux donc rien interpréter.

Je sais par contre que les 75°C c'est pour dénaturer l'enzyme et l'inactiver mais je ne vois aucun lien avec le protocole.

Merci de m'aider svp.
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[Meiosis]

J'ai une piste mais je ne suis pas sûr.

Est-ce que le fait de dénaturer à 75°C sans aucun substrat (ni NAD+ ni éthanol, cas A) ) et de comparer avec la dénaturation à 75°C avec un seul substrat(NAD+ seul ou éthanol seul, les 2 cas B) ) et ensuite rajouter l'éthanol ou le NAD+ en fonction de ce qui a été mis en premier permet de dire que les substrats ne sont pas dénaturés par la haute température (contrairement à l'enzyme) puisque la réaction se fait ensuite quand on repasse le tout à 30°C (donc avec l'enzyme aussi) et qu'on met le deuxième substrat manquant ? Je sais que la réaction se fait car j'ai mes valeurs d'absorbance de mon côté, elles ne sont pas nulles donc du NADH,H+ est produit (réaction se fait et forme aussi de l'acétaldéhyde).

C'est quand même bizarre car l'éthanol est réputé pour s'évaporer assez facilement, donc à 75°C j'imagine même pas donc je crois que je dis n'importe quoi.

[invitec9f0f895]

Salut

Il fut relire les protocoles, l'alcool n'est ajouté qu'après la dénaturation dans le 1, car les échantillons sont mis a 30°C AVANT l'ajout d'éthanol.
L'objectif est de déterminer s'il y a un effet des substrats la stabilité de l'enzyme.

YOyo

[Meiosis]

Salut,

Désolé je ne saisis toujours pas. Le but c'est de voir l'effet de la température très élevée sur l'enzyme, je ne vois pas pourquoi tu parles de l'effet des substrats sur la stabilité de l'enzyme. Je ne vois pas le lien ni pourquoi on fait tout ça, même en relisant. Ce serait moi j'aurais juste fait une partie réaction à 30°C et une autre à 75°C et je compare pour voir que la réaction ne se fait pas à 75°C, je ne vois pas pourquoi on parle de présence/absence de substrat combiné à 75°C...

[A voir en vidéo sur Futura]

[Meiosis]

Je crois comprendre ce que tu as voulu dire.

En fait dans l'expérience en absence de substrat on dénature l'enzyme à 75°C seule et ensuite on teste si la réaction se fait à 30°C en mettant les deux substrats seulement à ce moment-là.

Dans l'expérience thermodénaturation en présence des substrats on met à tour de rôle un des deux substrats avec l'enzyme durant la dénaturation à 75°C et ensuite on passe à 30°C en ajoutant le deuxième réactif manquant pour voir si la réaction se fait, en fait on veut voir si la dénaturation de l'enzyme à 75°C en compagnie d'un des deux substrats (NAD+ ou éthanol) a été plus ou moins empêchée par le substrat, si tel est le cas la réaction se fait ensuite lorsqu'on passe à 30°C. Je pense que c'est ce que tu voulais dire en disant "L'objectif est de déterminer s'il y a un effet des substrats la stabilité de l'enzyme." ?

Et donc le substrat aurait un rôle "protecteur" pour l'enzyme vis-à-vis de la haute température si l'effet est effectivement avéré, donc si la réaction se produit ensuite comme s'il n'y avait pas eu dénaturation.

Bon d'après mes valeurs d'absorbance celles-ci baissent quand même en présence des substrats durant la dénaturation (elles ne changent même pas par rapport au cas absence de substrat), je devrais donc en conclure que la présence d'un substrat durant la dénaturation ne change rien et l'enzyme est quand même dénaturée ?

[invitec9f0f895]

Salut

Bravo tu as compris le principe des expériences, c'est exactement cela.
Oui si tes valeurs ne changent pas tu peux en conclure cela.

Yoyo

[Meiosis]

Super. Par contre parfois je mesure une absorbance non-nulle pour des tubes où j'ai de l'eau à la place de l'enzyme, de l'ordre de 0,300 (c'est quand même beaucoup) est-ce normal ? Je ne pense pas car pas d'enzyme = pas de réaction donc pas de NADH,H+ produit donc absorbance nulle normalement.

J'avais émis l'hypothèse que peut-être l'acétaldéhyde se transformait spontanément en éthanol + NAD+ et cela sans enzyme (on a aussi étudié l'autre sens de la réaction) mais je pense que ce n'est pas l'explication car j'ai plusieurs autres blancs (eau sans enzyme) qui eux montrent une absorbance vraiment nulle, je ne vois pas pourquoi il y aurait une exception chez quelques "blancs" alors. Donc je pense que l'explication de la réaction spontanée n'est pas bonne ? Erreur expérimentale je ne vois que ça.

[invitec9f0f895]

Ca ressemble en effet à une erreur expérimentale.

YOyo

[Meiosis]

J'ai pourtant refait les mesures 2 fois mais bon j'ai dû mal faire un truc, même si je suis certain de ne pas m'être trompé dans les produits, bizarre.
Je te remercie pour tes réponses.