hybridation in situ : préparation de sonde ARN

[Meiosis]

Bonjour,

il y a quelque chose que je n'ai pas compris sur comment préparer une sonde ARN qui s'hybridera avec l'ARN complémentaire à détecter.
Si l'ARN est complémentaire il doit être orienté dans le sens 3' 5' (l'ARN "normal" l'est dans le sens 5' 3'). J'ai vu qu'il fallait faire une rétro-transcription à partir de l'ARN initial donc on retombe sur le cDNA et sur le brin transcrit. Ensuite on a les deux brins d'ADN avec la PCR.

Mais comme un seul des deux brins est transcrit lorsqu'on va vouloir faire la sonde ARN complémentaire on ne pourra que transcrire toujours le même brin, celui qui donne l'ARN de départ, donc on ne pourra jamais transcrire depuis l'autre brin pour avoir un ARN complémentaire.

Donc je n'ai pas compris quelque chose ?

Merci.
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[Meiosis]

Et je viens également de penser à autre chose concernant la révélation.
Imaginons que la sonde ne s'apparie pas (car absence de l'ARNm cible), on va quand même voir de la fluorescence au microscope vu qu'on a marqué la sonde, comment alors savoir si on voit la sonde libre ou appariée à son ARNm complémentaire ? À moins que ça soit fluorescent que si c'est double brin ?
Sinon je ne vois pas comment savoir si c'est apparié ou pas si on voit de la fluorescence dans les deux cas...

[invitecb7c417d]

Bonjour Meiosis, je découvre ta question, et j'en ai ouvert une récemment http://forums.futura-sciences.com/ch...ml#post5345961 (ne pas se fier au titre) mais un paragraphe est en relation direct avec le peu que j'en comprends :

En fait, j'ai demandé pour la colorimétrie, mais un équivalent comme technique (au niveau de la simplicité opératoire, de la mise en oeuvre, même si le substrat doit être fait en salle blanche ...), avec un solvant (l'eau serait l'idéale) ... comme par exemple, je dis une connerie : une longue chaine d'ADN monobrin dont l'unique présence avec son complémentaire fluorescent (enfin qui, lorsque l'appariment en double brin est effectif provoque une réponse, amplifiée par polymérisation successive des brins complémentaires restants (en temps que réactifs révélateurs excédentaires) et concentrant "la fluorescence" ?

La PCR, c'est bien PolyChainReaction (une polymérisation de l'ARN pour amplifier la détection ?) ; alors je me demande si tu pourrais peut être me confirmer que la présence d'une molécule (ici c'est un unique ARNm, si je comprends bien ...) et une seule (en solution aqueuse je présume ?) avec une réponse non ambigüe (la fluorescence) est significative ? Bon en tout cas je suis content de voir que c'est pas le truc mit en gras !

Si ça peut nous aider ?