Hybridation in situ: sonde ARN

[invitee737e07a]

Bonjour a tous,
J'ai une question probablement tres naive a poser, mais je ne suis pas specialiste du domaine.
Je mets au point une experience de FISH et je bloque au stade 1: preparer ma sonde. J'ai vu sur de nombreux protocoles, et sur ce forum, qu'il faut passer par un ADNc clone entre deux promoteurs bacteriens pour synthetiser sa sonde.
Ne serait-il pas possible de simplement commander des oligos ARN, correspondant a un fragment de la sequence anti-sens de l'ARN d'interet, et taggue par un fluorochrome en 3' ou 5'?
Merci d'avance!
-----

[invite160a5434]

Bonjour,

En attendant une réponse un peu plus précise et juste, la première chose qui me vient a l'esprit c'est que le fait de passer par un ADNc permet de voir l'expression ou non du gene que tu souhaites hybrider ...

[invitee737e07a]

OK... merci, je saisis mieux le probleme (assez logique en fait...)
Mais par exemple, je veux regarder les mRNAs de beta-actine dans des cellules humaines. Il existe des dizaines de sondes dont la sequence est donnee dans la litterature. Etant donne que je suis sure que mes cellules expriment l'actine et que sa sequence est tres conservee, il pourrait me suffire de faire synthetiser une de ces sondes?

[gorben]

Salut,

OK... merci, je saisis mieux le probleme (assez logique en fait...)
Mais par exemple, je veux regarder les mRNAs de beta-actine dans des cellules humaines. Il existe des dizaines de sondes dont la sequence est donnee dans la litterature. Etant donne que je suis sure que mes cellules expriment l'actine et que sa sequence est tres conservee, il pourrait me suffire de faire synthetiser une de ces sondes?

Tout a fait, mais la longueur max a etre synthetisee est 100 pb. De plus la synthese d'une amorce de 100 pb avec une grosse purif, un groupement detectable et une quantitee sufisante pour la manip doit probablement couter plus de 400E (un clonage ne coute "rien" ). Enfin, ta sonde ne sera utilisable QUE pour la beta-actine. C'est pour ca que beaucoup preferent faire des clonages et marquer les sondes dans le labo. Le kit de marquage n'est pas tres cher et peut etre reutilise des dizaines de fois.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]