les résultats de migration sur gel d'agarose

[invite194031d4]

Bonjour Flyingbike, bonjour tt le mondre,
s'il vous plait aidez moi à identifié la présence ou non d'un gène par l'utilisation de la PCR-RFLP conventionelle,alors nous avons commencé par la PCR, nous avons essayé 3 protocoles ils donnaient les mêmes résultats, par la suite nous avons passé à la migration des outils de restriction sur gèle d'agarose à 1% les résultats sont les suivante : voyez s'il vous plait les électrophoregramme joints, alors pour entamer la partie suivante aidez moi à comprendre la nature de bondes sur l'électrophoregramme est ce que ceux sont des résultats valable? est ce que l'adn n'est pas infecté (voyez smear) ? et est ce que ces bondes sont vraiment des bondes qui contient l'adn ou juste ceux sont les traces de bleu de bromophénol (suivi de la migration) qui sont détecté par le caméra.
La dernière question : comme vous remarquer nous avons pas utiliser des marqueurs de taille dans quelles cas on les utilises et vice versa ?
Merci de m'aider au plus tôt possible
Merci à vous
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[Flyingbike]

Bonsoir

Il manque juste l'image

[invite194031d4]

Bonjour
oui merci c'est à cause d'erreur de téléchargement le site affiche que mes images sont invalides,s'il vous plait donnez moi un de vos emails en mode privé pour que je puisse vous les envoyer
Merci Monsieur Flyingbike pour votre fedback qui est toujours positif

[Flyingbike]

Vous avez suivi ces indications ? : http://forums.futura-sciences.com/id...procedure.html

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite194031d4]

Bonjour merci bcq
Alors comme vous allez voir sur l'électrophorégramme à partir de la gauche vers la droite la 1 bonde c'est le témoin négatif et les 2et 3 èmes, sont des bondes séparées par le protocole 1 et les bondes 4,5et 6 sont traitées par un 2ème protocole
Merrci

[Flyingbike]

!
il n'y a pas grand chose a voir... C'est une image UV ? Vous ne déposez pas de marqueur de PM ?

Quelle est la différence entre les 2 gels ?

Les taches sombres qu'on voit une fois sur 2 ça doit etre du bleu

[Pfhoryan]

Les bandes foncés sont effectivement le bleu de bromophénol.
Dans le premier gel on voit quelques smir => La PCR est foireuse.
Cherchez de meilleure conditions (qualité de la polymérase, température d'hybridation?) ou changez de primer...

Bon courage!

[invite194031d4]

Rèponses pour Monsieur Flyingbike
la différence entre les 2 gèle cest que pour le 1er protocole nous avons utilisé le géle d'agarose à 1% et pour le second nous avons utilisé 0.5%,
pour les bondes voyez s'il vous plait maintenant après la résolution ( nous avons utilisé pour la capture "smartgel V7.1 ", je ne maitrise pas encore la méthode de capture, je suis entrain de l'apprendre)

La répense pour Pfhoryan
Nous avons pas des smears. Voyez s'il vous plait l'électrophoraigramme d'un exemple des smears dans notre cas je pense que juste le chemps de migration qui est pour vous des smears, juste je pense parce que je suis qu'un débutant et je veux pas commencer à apprendre des fautes,donc essayez de me donnez les détails des détails pour mieux comprende c'est quoi un smear ?

Merci à vous

[invite194031d4]

Bonjour Monsieur Flyingbike,
S'il vous plait j'attends votre réponse, je sais bien que vous avez une solution dites moi ce que je vais faire
Merci à vous

[Flyingbike]

Il va falloir nous en dire plus sur les conditions : vous amplifiez quoi ? a partir de quoi (génomique, ADNc ?) Et vous vous attendriez a voir quoi ?

Sur le second gel, il y a clairement de l'ADN dans le puits...

Avez vous des contrôles négatifs (sans polymérase, et sans ADN ) ?


Il faut toutes les informations !

[invite194031d4]

Bonjour Monsieur Flyingbike,

On amplifie une séquence d'ADN (exon 7), qui est la responsable de la maladie de l'amyotrophie spinale,l'extraction de l'adn se fait à partir du sang et nous attendons à voir la présence ou non de l'exon dite.Pour plus de compréhension veuillez voir Van der stege et al 1995.
Autres questions s'il vous plait comment calculer le volume de la BET à ajouter dans le gèle d'agarose à 1%(je veux la relation générale s'il vous plait ), sachant que les informations notées sur le tube de stock sont les suivants : 10 ml (10Mg/ml) (Invitrogen) et quelle la méthode la plus pratique est ce que j'ajoute le BET directement dans le gel ou après la migration et la coloration(après la migration sur gèle),et comment calculer le volume du bleu de bromophénol (le colorant) à ajouter pour suivre la migration de l’échantillon de l'ADN ?

Merci à vous

[invite34baa467]

Pour la concentration en BET, je ne peux pas vraiment te répondre. Nous mettons un volume arbitraire de 15µl par gel dans mon laboratoire et 8µl de sybergreen (alternatif du BET, mais moi efficace). Par contre il faut que tu sache que le BET se met pendant la polymérisation de ton gel. Il est un intercalant de l'ADN donc si tu le mets après il ne pourra pas vraiment s'intercaler vu qu'il aura du mal à passer le polymère d'agarose. Pour le bleu de commassie , il sert juste à colorer pour voir ton front de migration, même si il y a aussi un peu de glycérol permettant le dépôt. Donc je te conseille de mettre juste de le mettre au 1X, donc 1µ pour 5µl d'ADN donc 2µl pour 10µl.

Voilà j'espère avoir pu t'aider, ne m'ayant jamais poser sur une concentration de BET, je ne peux pas te répondre mais je suis sur que quelqu'un pourra t'éclairer

[invite194031d4]

Bonjour,
Merci Neoange pour votre réponse
Bonne journée