Trouver la taille d'un insert après électrophorèse ?

[inviteb619a0d7]

Bonsoir,
Je cherche à vérifier si mon plasmide possède bien l'insert fait dans une expérience préalable. Pour celà j'ai effecué une digestion par la même enzyme que pour l'insert (BamHI) + une autre digestion avec une autre enzyme (PstI)). Ensuite je fais une électrophorèse. Est-ce que cette dernière va faire apparaitre :
- 2 traits donc 1 du plasmide sans insert et l'insert seul(identifiable car plus grand qu'un site de clonage?) (cas post-digestion BamHI) ?
- 1 trait correspondant au plamide + insert le tout linéarisé par PstI ?

Sinon comment peut-on, à partir d'une électrophorèse, conclure sur le fait que mon gène d'intérêt a bien été transféré sur mon plasmide ?

Toute aide est la bienvenue, merci d'avance pour votre lumière
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[Flyingbike]

Il en faut un peu plus : tailles observées, taille du vecteur, taille de l'insert, carte, etc...

Si vous avez cloné avec BamH1, vous devrez observer après redigestion votre vecteur linéarisé et votre insert.

Pour Pst1 tout dépend de l'emplacement du site

[inviteb619a0d7]

En fait pour le moment c'est théorique, l'electrophorèse est prévu pour mon prochain TP mais il nous est demandé de savoir à l'avance comment il se déroule. Voilà la seule donnée que nous possédons (il s'agit du plasmide avant l'ajout de l'insert) :

[Flyingbike]

si dans l'insert il n'y a ni pst1 ni BamH1,

la coupure par Pst1 donnera une bande a la taille plasmide+insert (1 coupure)

la coupure par BamH1 donnera une bande a la taille plasmide et une bande a la taille insert (2 coupures)


ça vous parait logique ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb619a0d7]

Oui c'est bien ce que je pensais ! Merci

Il y a malgré tout un petit détail qui me chiffonne. Je vais l'illustrer avec un exemple. L'enzyme BamHI digère la séquence
G/G A T C C
C C T A G/G
Après digestion on catalyse avec des ligases le gène d'interêt. Mais se peut-il que le gène ai une séquence différente de :
-.......G-
-G........- ?
Car s'il est différent, alors BamHI ne devrait plus reconnaitre de séquence lors d'une redigestion Mais les bases seraient quand mêmes complémentaires donc ça laisserai possible le "collage". La séquence serait devenue :
-G....................XGATCC-
-CCTAGX............CTAGG-
Avec X différent de G, les bases rouges sont du gène et les vertes du plasmide.

[Flyingbike]

Oui ça peut arriver quand on fait des clonages avec des "extrémités compatibles"

C'est à dire qu'on digère un fragment avec une enzyme, un autre fragment avec une autre enzyme qui reconnait un site différent mais qui produit des extrémités cohésives identiques

Par exemple BamHI

GGATCC
CCTAGG

et BclII

AGATCT
TCTAGA

ça produit

G
CCTAG

et

 GATCT
     A

Les extrémités sont compatibles

Après ligation :

GGATCT
CCTAGA

Qui n'est plus clivable par BamHI ni par BglII (mais par DpnII par exemple)

[inviteb619a0d7]

Merci pour cette précision !