Fragment de Klenow - glace- séparation brins

[lb29]

Bonjour,

j'ai une question à propos du fragment de Klenow (définition wikipédia : https://fr.wikipedia.org/wiki/Fragment_de_Klenow).
J'utilise cet enzyme afin de synthétiser le deuxième brin d'ADN lors d'une rétrotranscription. Je me demande s'il est nécessaire de mettre les tubes dans la glace avant le run (37°C 10 min pour la synthèse puis 75°C 10 min pour l'inactivation de l'enzyme), afin de garder les brins séparés. Une déshybridation par la chaleur n'est pas présente dans le run car elle risquerait je pense de dénaturer la Klenow (cf inactivation à 75°C).
Cette étape de glace n'est pas indiquée dans la notice du fournisseur, cependant, elle est retrouvée dans des protocoles similaires utilisant la T7 DNA Polymérase ou la Sequenase (https://en.wikipedia.org/wiki/T7_DNA_polymerase) utilisées dans le même but.

Merci d'avance pour votre aide,

lb29
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[Flyingbike]

garder les brins séparés ? normalement si vous utilisez la klenow vous avez de l'ARN simple brin, non ?

vous n'incubez pas avec une amorce ?

[lb29]

Merci pour cette rapide réponse

J'incube en effet avec une amorce.
Je n'ai en effet pas précisé que je travaille sur extrait d'ARN viral. Il y a d'abord la synthèse d'un premier brin ADNc par une rétrotranscriptase SuperScript III (ce run de RT se termine par 70° pendant 15min) puis je me sers de la Klenow pour synthétiser le second brin d'ADN. Ma question est donc de savoir si la Klenow va bien réussir à avoir accès au premier brin d'ADNc pour synthétiser le second, c'est-à-dire s'il n'y a pas un risque de réhybridation des brins ARN matrice-ADNc lorsque je sors mes tubes du thermocycleur (et qu'ils restent quelques minutes à t° ambiante). D'où la question de faut-il plonger les tubes immédiatement dans la glace a la sortie de la RT avant de rajouter le mix de Klenow
En espérant que cela est plus clair ainsi

[Flyingbike]

Ok !

Vérifiez si votre reverse a une activité RNase, la SSII n'en a pas, la SSIII je ne pense pas non plus

Dans ce cas oui cela ne coute rien et ne craint rien de mettre les RT dans la glace apres inactivation de la SSIII pour éviter les hétéroduplex ADN/ARN. Par contre dire si c'est indispensable.... ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[lb29]

Pas d'activité RNAse pour la SSIII à priori. Merci des conseils, je vais tester ainsi