retard sur gel

[invite5874c895]

Bonjour, je travaille sur une protéine qui régule la transposition simple brin des séquences d'insertion IS200/IS605. in vivo, l'effet est bien visible mais in vitro, j'ai essayer de voir l'interaction de cette protéine avec des oligo simple brin marqué au P32 (extrémité droite, extrémité gauche, cible) et je n'ai pas d'interaction( pas de liaison de ma protéine sur ces oligo). est ce que cela signifie que ma protéine n'a pas d'effet directe sur ces oligo, et la question que je me pose est ce que les conditions d'EMSA pourrait déstabilisé le complexe protéine-ADN?

(gel retard TGE 1X acrylamide 8%)
-----

[Flyingbike]

La technique EMSA est extremement complexe tant les paramètres sont nombreux.

Pensez vous qu'il y a une interaction directe ? La nature des échantillons par exemple est très critique : protéine recombinante pure, extrait enrichi, extrait total, etc....

En plus de cela : concentration en sels, ratio sonde-protéine, pH, temps d'incubation du complexe, température d'incubation du complexe......

Avez-vous une protéine témoin dont vous etes sur de son interaction avec votre sonde ?


Deja, est-ce que vous voyez bien la sonde marquée libre ?

[invite5874c895]

Merci Flyingbike pour ta réponse
c'est une proteine recombinante pure, et je pense que la protéine est inactive in vitro vu sa structure (HTH, doigt de zinc) lui permet normalement de se fixer sur les oligo marqués . et la seule hypothese que je peux y mettre est que ma proteine est activée par des proteine chaperonnes.
effectivement, je vois bien mes oligos marqués qui migre à la mm vitesse en présence et en absence de ma protéine et je pense que je dois vérifier certains paramètres de ma technique .
merci pour ton aide Flyingbike

[Flyingbike]

Pourquoi ne pas essayer avec un extrait protéique contenant votre protéine que vous savez active, et de tenter un supershift ou une inhibition avec un anticorps spécifique ?

Rien ne garantit que votre protéine, seule, peut se lier à l'ADN (pour avoir pas mal bossé sur des facteurs de transcription, les complexes protéines-ADN ça peut etre réellement compliqué)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5874c895]

cette proteine comporte trois domaine: un domaine HT, un autre central presentant des homologies avec le domaine catalytique de la proteine cas9 (CRISPR/cas) et RuvC (resolvase) et un motif en C terminal doigt de zinc. j'ai fait des test on me focalisant sur la relation structure -fonction de cette protéine et tout les tests sont révélés négatifs . test de clivage sur substrat double/simple brin , test de binding substrat double/simple brin (gel retard, dot blot) et je pense que l'effet de cette proteine n'est pas directe ou elle n'est pas active . j'ai essayer sur des extraits proteique nada pareil pas de retard

[Flyingbike]

Du coup le souci n'est peut etre pas expérimental...s'il n'y a pas de liaison.

Vous pourriez essayer autre chose? (ChIP par exemple)