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CT variable



  1. #1
    marrymine

    CT variable

    Bonjour,

    j'aurai quelques questions a poser j’espère avoir une réponse de votre part.
    je suis en stage en M2, j'ai comme objectif de mesurer la variabilité de l'expression de certains gènes d’intérêt, pour cela j'ai dessiné des amorces qui ciblent ces gènes dans différentes espèces bactérienne. Je suis entrain de faire la validation des amorces j'ai donc fais une gamme étalon avec 5 différentes dilutions de mon échantillon ( facteur de dilution 2), et de différentes concentrations d'amorces dans le mélange réactionnel. j'ai eu du signal pour presque toutes les dilutions, les résultats de validation d'amorce que j'ai sont loin d’être satisfaisant du fait que les ct sortent de manière désordonné et très variable, c'est a dire vu que j'ai un facteur de dilution de 2 je devrais avoir deux ct de différence entre chaque dilution, et plus la concentration en ADN initiale est élevé plus le ct sort plus tôt. j'ai eu le contraire sur mes échantillons ( sur les faibles dilutions j'ai eu un ct faible, sur les grande un ct elevé), j'ai eu des je ne comprends rien a ces résultats , je me demande est cela est lié au inhibiteurs?
    heeeeeeelp please

    -----

    Images attachées Images attachées

  2. #2
    Loupsio

    Re : CT variable

    C'est pour le moins original

    déja l'intensité de fluo varie en fonction de l'étape du cycle, mais si tu prend l'intensité de fluo uniquement à l"étape ou les brins sont hybridé, alors tu n'est pas censé avoir de baisse puisque ca reviendrai a dire que tu as perdu de l'ADN si tu as moins d'intensité qu'au cycle precedent (comme on peut le voir pour les cycles 10, 13, 14, 15, 19 sur ton graphe
    'ailleurs aux alentours des cycles 20 tes graphes sont coupés? oO


    pour les Ct, tu es bien sur que tu n'as pas inversé des dilutions?
    les dilutions les plus grandes sont bien censé sortir plus tard, si ce n'est pas le cas, tu as du te tromper, car tes amorces ont la même efficacité dans tous tes puits ducoup elle ne peuvent pas bosser plus rapidement ou plus lentement selon le puit, si l'efficacité e tes amorces est de 2, elle est de 2 partout

  3. #3
    marrymine

    Re : CT variable

    Merci pour ta réponse rapide Loupsio

    les graphes ne sont pas coupés je les ai copié tel quel du logiciel sds.
    Oui après avoir vu les résultats j'ai douté sur les erreurs de manips(que j'ai inversé les dilutions ) mais je me rappelle bien avoir bien suivi mon plan de plaque. je préfère encore m’être tromper sur les dilutions et refaire une gamme que ça soit du aux éventuels inhibiteurs qui ont peut être du interférer dans ma qPCR et a ce moment la refaire les extractions. je me pose cette question parce qu'ayant eu des rapport 260/230 <1.8 cela indique que mes ARN sont contaminés par des protéines /solvants....
    je vais refaire une autre qPCR

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