bonjour tout le monde,
SVP j'aurais besoin de désigner des amorces pour réaliser une PCR quantitative dans le but de quantifier le nombre de copies d'une famille d'élements transposables.
D'arès mes connaissances les amorces doivent etre spécifiques pour quelles ne s'hybrident pas à des régions autres que mes cibles.Mais est ce que je peux désigner des amorces dégénérées etant donnée que les séquences présentent des variations meme dans les régions conservées?
Merci!
Des amorces dégénérées pour une qPCR ? Non. Sinon l'efficacité d'amplification dépendra majoritairement de la probabilité d'hybridation de tes amorces et non plus de la quantité d'ADN.
bonjour Tibosax
Je vous remercie de votre réponse, en fait j'ai pensé aux amorces dégénérées car les élements transposables sont très ariables et mme dans les regions conservées il existe des substitutions (mutations ponctuelles)
donc le but c'était de quantifier le maximum de copies pour avoir une estimation sur le nombre.
Je vous remercie encore une fois
dans ce cas, si c'est vraiment infaisable (faut aligner toutes les séquences pour voir si on a quelques chances de poser des amorces) on peut faire des PCR multiplex (avec des pools d'amorces) mais la mise au point est du coup beaucoup plus complexe (notamment l'efficacité a prendre en compte)
La vie trouve toujours un chemin
merci Flyingbik,
en fait j'ai fait l'alignement des séquences nucléotidiques que j'ai identifiées par des PCR et j'ai trouvé que certains sites pourraient correspondre à des A ou des T ou à des G ou des C donc je me suis proposée de faire des amorces dégénérées avec des W ou des S avec un meme Tm pour toutes les amorces (60°C).
Ceci pourrait il affecter la PCR?
dans la mesure où l'efficacité ne serait pas comparable selon la cible amplifiée, oui. Et attention, une amorce dégénérée est d'autant moins spécifique, c'est à vérifier !
La vie trouve toujours un chemin
