Calcul de ratios en real time RTqPCR: Combinaison de gènes de référence.

[invite3b8d0ce3]

Bonjour à tous:
J'ai une question concernant l'utilisation d'une combinaison de gènes de ménage dans le cadre d'un RTqPCR.
Voici mon scénario:

J'étudie le niveau d'expression d'un gène A, j'ai à ma disposition 40 échantillons (d'ARN total issu d'extraction). Je ne peux passer que 10 échantillons par série sur les machines de RT qPCR. Je dois donc les passer en 4 fois. Pour homogénéiser les differentes séries, je dispose d'un échantillon calibrateur que j'utilise à chaque série de RTqPCR.
Le gène de ménage utilisé est GAPDH.
Pour le calcul du Ratio de mon gène A par rapport au gène de ménage sur un échantillon, et normalisé par rapport à mon calibrateur:


où:
Ct: cycle seuil (Threhold)
E: efficacité (variant entre 0 et 1)
Cal: calibrateur
Ech: Echantillon (un échantillon donné, parmi les 40)


Je me suis rendu compte que le niveau d'expression en ARN de GAPDH n'est pas stable d'un échantillon à l'autre, j'ai ajouté deux autres gènes de référence (ESD et PLOR2A).

Afin de trouver la formule permettant d'utiliser Ct combiné J'ai trouvé l'article dont voici le lien: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC126239/

C'est dit que la moyenne géométrique des est préférable: soit

Avec la combinaison des 3 gènes de ménage, la formule de ratio devient:


Jusqu'ici pas de problème, mais du coup mes efficacités , et
ne sont pas égales, comment je calcule ??
Est-ce que c'est aussi une moyenne géométrique des efficacités des 3 gènes de ménage? (Comme je n'y connais pas bien et je n'ai rien trouvé comme solution, je ne voulais pas partir dans les conneries...)


Merci de votre aide!

NB: je ne sais pas si vous aussi, lorsque vous testez la stabilité de vos gènes de ménage avec Normfinder ou Genorm, il arrive que le gène d'intérêt soit plus stable.
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[invite3b8d0ce3]

Juste un Up.

[Loupsio]

Bonjour,
Je n'ai jamais utilisé plusieurs gènes de ménage donc je ne peux pas trop répondre a chaud pour le calcul, (peut être que Flyingbike saura), mais j'ai une question,
Si tu sais que ton gène de ménage initial n'est finalement pas stable, pourquoi ne pas prendre en compte juste les references stables? car tu limites le iais en prenant en compte plusieurs gènes de ménage, mais tu laisse un biais du a celui qui n'est pas stable et viens influencer le résultat
alors qu'en ne prenant que un gène (ou deux) dont tu es sur d'être stable, tu évitera le biais du aux gènes non stable

[invite9b315ae0]

Bonjour,
En qPCR généralement j'utilise comme gènes de ménage RPLO et UBB. Je confirme que je fais la moyenne des efficacités
Bonne journée

[A voir en vidéo sur Futura]