Problème de rendement kit Maxiprep

[inviteffc2b2e2]

Bonjour à tous.

Je me retrouve confrontée à un gros problème de rendement sur des maxipreps.
En effet, en fonction de l'insert présent dans mon vecteur (high copy je précise), je me retrouve parfois avec des rendements de maxipreps vraiment minables (du genre 8µg maximum). Sachant que ma manip est ensuite suivie d'une précipitation à l'éthanol pour concentrer mon échantillon et que je perds encore un peu de matériel à cette étape, il ne me reste plus grand chose à l'arrivée.
Pour la suite de mes manips, j'aurai besoin d'environ 100µg de ma construction. Vous imaginez bien le malaise...

Existe-t-il des solutions pour augmenter la production de vecteur par la bactérie ? Des astuces pour améliorer le rendement de ma maxiprep ?

Merci par avance pour vos réponses.
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[Loupsio]

Bonjour,
Laisser incuber dans ton milieu liquide plus longtemps de façon a avoir plus de bactéries lorsque tu récupère tes plasmides?
Tu peux aussi pooler au moment de l'élution,
par exemple faire deux extractions parrallèles (en suivant le protocole normal), et au lieu de récupérer dans (par exemple) 100µL en déposant ces 100µL sur ta membrane, utiliser 50µL sur ta membrane ou tu as retenu ton premier lot de plasmides, et transférer le tube d'élution sous ta deuxième membrane et éluer avec 50µL aussi,
Tu récupềreras moins de chaque, mais plus au total

Mais commence déjà par essayer de laisser tes bactéries se développer plus longtemps, plus de bactéries = plus de plasmide (pas trop longtemps non plus car si tu sature tu auras des problème de rendement aussi, mais attend que ta culture liquide soit quand même bien trouble et nuageuse)

[Flyingbike]

quelle est votre DO au moment de la lyse ? Il y a le coup du chloramphénicol qui marche bien

[inviteffc2b2e2]

Merci à vous 2 pour vos réponses.

@Loupsio : Je pensais qu'une culture O/N c'était bien suffisant...
Je peux effectivement pooler mes différents élutions mais comme dit, si j'obtiens 8µg à chaque maxiprep et qu'il m'en faut 100, je peux pooler longtemps (13 fois en théorie). (et nous sommes conscients qu'au prix de la maxiprep, ça devient plus du tout rentable cette histoire).

@Flyingbike : J'avoue ne pas mesurer la DO de ma culture avant récolte des bactéries. J'ensemence ma culture au 1/100ème en fin d'après midi à partir d'un starter. Je récolte seulement le lendemain matin. La culture est à ce moment là bien trouble.
Le coup du chloramphenicol ? Quésako ?

Je pense tenter à l'occasion un protocole pour plasmide low-copy même si ce n'est pas le cas à l'origine.

Il n'y a pas de souches ou de milieu de culture/additifs "miracle" pour me permettre d'amplifier plus de plasmide ?
Comment la séquence de mon insert peut-elle jouer sur la quantité de plasmide présente dans mes bactéries ? (j'ai conscience que plus l'insert est gros, plus la réplication est lente, mais encore ? D'autres paramètres influencent-ils la réplication ? )

[A voir en vidéo sur Futura]

[Loupsio]

Le fait est que si c'est un plasmide multi copy, tu ne devrais pas avoir de problème de rendement avec un kit, c'st pour ca qu'on mentionne ta culture bacterienne (laisser plus longtemps ou vérifier la DO pour voir si ta densité est assez élevé). Overnight est censé être suffisant mais mettre en culture vers 16-17h et récupérer le lendemain vers 10h, c'est un peu plus que overnight et ca marchait très bien pour moi, mais si c'est bien trouble ca devrait etre bon normalement (et oui prend ta DO mesure un zéro et celui avec les bacteries avant incubation, puis remesure les deux après incubation)

Le chloramphenicol comme Flying le propose, permet d'empecher ta bactérie de se diviser, mais sans empecher la réplication du plasmide, tu peux donc laiser plus longtemps (pour avoir pus de plasmide) sans saturer en bactérie car elles arretent de se mutiplier quand tu ajoute le chloramphenicol,

pour les souches "miracle", je ne sais pas ce que tu utilise, mais j'utilisai du E. coli DH5 et ca marchait très bien dans du LB classique , mais je pense que n'importe quelle souche doit se comporter de la meme facon.

[inviteffc2b2e2]

Merci pour ce complément d'infos.

J'étais justement en train de faire des recherches sur l'ajout de chloramphenicol mais c'est recommandé pour les plasmides ayant une origine de réplication pMB1 ou ColE1. D'après la carte de mon plasmide, ce n'est pas le cas (quoique je m'interroge quand même car il a une "pUC ori" donc s'agit-il d'une origine pMB1 ? J'ai l'impression que j'ai trop de lacunes dans mes connaissances...). Bon, vous allez me dire, je perds pas grand chose à tester de toute façon.


Pour ce qui est de la DO de ma culture, je ne la mesure pas mais la turbidité de ma culture me semble tout à fait normale par rapport à d'autres cultures où mes maxipreps se passent sans souci. Je vérifierai néanmoins lors de mon prochain essai.

J'utilise du LB aussi. Je vais aussi essayer de changer de souche (j'utilise actuellement une souche d'expression ce qui n'est pas l'idéal j'en conviens mais il me semble qu'un ancien essai en souche "pour clonage" n'ait pas donné de résultats plus concluants).

[Loupsio]

Tu arrives a extraire des plasmides avec les memes bacterie/plasmide mais pour d'autres inserts?
Verifie que ta séquence est bien dans le plasmide (que ta bacterie a pas ingéré un plasmide vide)
et aussi que ton gène ne peut pas etre la cause, par exemple si c'est un inhibiteur de réplication, une nucléase non spécifique... quelque chose qui ferait que c'est l'expression de ce gène par la bactérie qui entrainerait le problème

[inviteffc2b2e2]

Oui, j'arrive à extraire des plasmides avec les mêmes bactéries/plasmides mais pour d'autres inserts (ou même avec du plasmide vide) avec des rendements plus que corrects.

Après chaque transformation, je vérifie que ma bactérie a bien ingéré vecteur + insert et j'isole le clone correct et travaille uniquement avec celui-ci.

Du coup, si c'est la nature du gène qui pose problème (inhibiteur de réplication, nuclease ou autre), cela signifie qu'il y a une activité résiduelle de l'expression de mon vecteur dans ma cellule ? Est-il possible de bloquer cette activité ?

[Loupsio]

Tu as dit que tu utilisais une souche d'expression, pour peu que ton gène possède tout son CDS et qu'il y a un promoteur dans le plasmide, si la bactérie l'exprime correctement il se peut que cette protéine ait un effet,
bien souvent quand ca arrive, on observe plutot un auto-empoisonnement et donc elles ne se reproduisent pas, donc vu que tes bactéries se développent il n'ya pas auto-empoisonnement, mais on sait jamais, si c'est une protéine qui joue sur la régulation des plasmides ou sur les séquences génétiques (sans toucher au chromosome et donc a la viabilité) peut etre que ta protéine est la cause

Après si tu me dit que c'est censé être une simple aclool deshydrogénase, ou un gène commun du même genre... ya peu de chance que ce soit du à l'expression,
mais si ton protocole marche entre tes mains avec les mêmes éléments pour d'autres gènes, je ne vois que ça

[inviteffc2b2e2]

Merci

J'ai relancé une souche Top10 et la semaine prochaine, je lancerai des tests de maxiprep sur une culture "classique" et sur une culture avec addition de chloramphenicol. Du coup, j'attends les résultats avec impatience (je regretterai presque que le weekend soit si proche, mais presque hein) !

[inviteffc2b2e2]

Petit point informatif : je n'ai pas noté de différence de rendement entre une culture sans et avec chloramphénicol (après, je fais une estimation de la quantité uniquement sur gel donc si cela se joue à quelques ng/µL, je ne peux pas le visualiser).
En revanche, le changement de souche a été radical sur ma construction : je passe d'environ 8µg/100mL de culture en souche "type expression" à environ 500µg/100mL de culture en Top10...
Après, j'ai perdu 50% de ma construction avec les cycles endotoxin removal / précipitation à l'éthanol mais comme j'ai assez pour la suite des manips, ça me va

La semaine prochaine, je reteste sur d'autres constructions "récalcitrantes" !

Encore merci à ceux qui m'ont apportée leur aide

[Loupsio]

Super nouvelle, bonne chance pour la suite,

Bonne continuation