test d'efficacité de primers pour RT-qPCR

[Harley Quinn]

Bonjour,

Je travaille depuis un an dans un labo à l'étranger où je viens de rencontrer un procédé que je trouve curieux, donc j'aimerais avoir l'avis de plusieurs personnes sur le sujet. Après avoir épluché le forum et la toile en général, je ne trouve personne d'autre que moi qui ait été confronté à cette pratique.

Nous devons lancer plusieurs runs de qPCR avec de nouveaux primers (pas de quantification absolue avec une courbe standard, juste de la quantification relative). Nous voulons donc tester l'efficacité de la réaction pour comparer les niveaux d'expression entre nos gènes de référence et nos gènes d'intérêts.

Pour ce faire ici les techniciens amplifient une gamme de dilution de primers sur toujours la même concentration de cDNA, et pas le contraire. J'ai toujours fait le contraire, tester l'efficacité d'amplification de mes primers à la concentration à laquelle je les utilise le long d'un gradient de cDNA.

Savez-vous quel est le but de cette méthode par rapport à la mienne ?

Merci !
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[Flyingbike]

C’est grotesque
Une gamme de primer peut éventuellement servir à optimiser des conditions de pcr
Mais pour de la quantification relative, la chose importante est de connaître l’efficacite de PCR en faisant varier la concentration de cDNA.
c’est la seule façon de déterminer l’efficacité et de faire de la vraie quantification relative. Je ne vois pas du tout l’intérêt de faire bouger la concentration des primers....

[Harley Quinn]

Moi non plus, je vais creuser un peu plus savoir si c'est VRAIMENT l'efficacité de la réaction que mes prédecesseurs avaient l'intention de tester.

Merci !

[fadiahs]

Bonjour,
Je saute sur l'occasion pour demander conseilles par rapport a mes RT qPCR, En fait j'ai fais plusieurs PCR afin de tester l'expression de certains genes par rapport aux genes de références, mais j'ai toujours le meme probleme l'efficacité n'est pas bonne (un coup ça dépasse 100%, un coup c'est entre 50 et 70%) (pourtant les droites sont biens, j'ai de beaux pics a la melting Curv...) je ne comprend pas ce qui cloche lors de ma manip, j'ai beau refaire plusieur fois, modifier ma maniere de pipeter, changer l'echantillons de la gamme, changer les Primers .. Je ne sais plus quoi fair, pouvez vous me donner des astuces pour avoir une bonne éfficacité de PCR ?
Je vous remercie

[A voir en vidéo sur Futura]