RT qPCR

[invite42c2e553]

Bonjour,
je voulais faire une reverse transcription pour à la suite réaliser une qPCR sybr green. Classiquement j'ai préparé mes échantillons en les mélangeant avec de l'eau, des dNTPs, des Random primers et l'ARN d’intérêt et finalement au moment de les dénaturer je me suis rendu compte que le thermocycleur était hors service. Ma question est la suivante: est ce que les échantillons peuvent être gardés à -20°C en attendant que le thermocycleur soit opérationnel ou dois-je recommencer la manip pour une meilleure RT.
Merci
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[Flyingbike]

faites la au bain marie !

[invite42c2e553]

J'y avais pas pensé. Mais ma question. Demeure toujours la même est ce que les échantillons sont toujours bon ou pas?

[Flyingbike]

alors les mix de qPCR se gardent généralement bien a 4

Les RT je ne sais pas, l'ARN est mieux a -20 mais l'enzyme une fois diluée j'ai un doute...

A votre place je recommencerai (a défaut de la faire le jour même au BM)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite42c2e553]

En gros dans le mélange que j'ai fait il y a seulement l'arn,les dntp, l'eau et les random primer. Mais bon je vais suivre vos conseils pour être sûre.
Merci de votre aide en tout cas

[Loupsio]

S'il n'y a pas d'enzyme, il n'y a pas de souci,
Les enzymes se gardent à -20 dans leur solution stock, mais en réalité les protéines n'apprécient pas trop la congélation/décongélation et elles peuvent perdre leur activité enzymatique,
Pour contrer cela on rajoute bien souvent du glycerol pour éviter ce phénomène, c'est pour ca que votre enzyme dans sa solution stock est conservée dans du glycerol (qui sert de cryoprotectant) et qu'elle est à -20
Ce que Flying voulait dire, c'est que si vous avez mis l'enzyme, dans votre mix et que votre tube est retourné à -20, le glycerol est devenu minoritaire dans votre solution et votre enzyme dans l'eau ne va pas apprécier la congélation

En revanche si vous n'avez pas mis l'enzyme, il ne devrait pas y avoir de souci si vous êtes ric-rac niveau temps ou matériel, il vous suffit de décongeler votre MasterMix et de rajouter l'enzyme et mettre en RT (après si vous avec le temps et le matériel pour recommencer, ne vous privez pas)

[invite42c2e553]

Bonjour,
merci pour vos réponses. Finalement j'ai conservé mon mix ( ARN, random primer, eau et dNTPs) à -20°C et j'ai effectué la RT le lendemain et j'ai été ravie de voir après la qPCR que cela n'a pas posé de problèmes