qPCR

[invite61d76751]

Bonjour,

Au laboratoire où je travaille, il nous a été vivement recommandé de réduire nos coûts d fonctionnement et de rationner certains réactifs, notamment pour les qPCR.
Dans ce but, je cherche à mettre au point un protocole pour réduire les volumes de Sybr Green Master Mix utilisé. Jusqu'à présent j'ai exploré deux voies :
- J'ai commencé par réduire les volumes réactionnels tout en conservant les des concentrations identiques en Master Mix, amorce et cDNA, à savoir que nous travaillons sur une machine ABI Prism 7000. Les volumes utilisés sont 25µL, 20µL, 15µL et 10µL, mais je trouve les écarts-types un peu élevé. J'ai regardé avec cette gamme le gène CA-IX en normoxie et en hypoxie.
- ma deuxième approche a été de diminué la concentration en Master Mix tout en gardant un volume réactionnel de 25µL, avec les concentrations suivantes : 1X, 0.5X, 0.3X et 0.25X; le Master Mix est à une concentration de 2X. Ici, j'ai regardé CA-IX et 18S afin de normalisé l'expression de CA-IX par rapport à celle de 18S. J'observe deux phénomènes : Une diminution de du ratio CA-IX/18S à mesure que diminue la concentration en Sybr Green, que ce soit en condition normoxique, qu'en condition hypoxique. La deuxième observation est une sortie de 2 Ct plus tôt de tous mes gènes, avec une concentration en Sybr Green à 0,5X par rapport à une concentration de 1X. Sachant que pour les concentrations inférieurs les Ct de sortie sont identiques.

Ce phénomène serait-il dû à une saturation du milieu réactionnel en Sybr Green, qui inhiberait la fixation correcte des molécules de Sybr Green sur les doubles brins d'ADN pendant l'établissement de la courbe de fusion.

Merci pour vos réponses.
-----

[Flyingbike]

Avant toute chose, ce qu'il faut regarder ça n'est pas du tout le Ct mais surtout l'efficacité de réaction.

Peut être qu'a 0,25X tu sors plus tôt mais il faut aussi que ça reste quantitatif.

Il est difficile d'expliquer le phénomène, car en changeant la concentration du tampon (qui contient effectivement un système tampon et des sels), tu modifies notamment les points de fusion des produits et des oligos. Ca peut devenir très compliqué.

[kamor]

Je suis d'accord avec Flyingbike, jouer sur la concentration du mix et donc de ces composés me parait plus risqué. Tu pourrais même te retrouver avec des amplifications aspécifiques non détectées. Et en réduisant la concentration en MgCl2, tu réduis la force du couple amorce / ADN, pouvant réduire ton efficacité.
La fixation du SybrGreen sur la molécule d'ADN est en fait encore à l'heure actuelle assez peu connue, il y a des effets qu'on ne soupçonnait pas comme une préférence de site de fixation (S. Giglio, P.T. Monis, C.P. Saint, Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to speciWc DNA fragments in real-time multiplex PCR, Nucleic Acids Res. 31 (2003) e136.)
Une autre possibilité est de changer de fluorophore. Il existe maintenant des flurophores dit de 2de génération qui sont plus spécifiques que le Sybr Green. J'ai pu ainsi réduire mon volume avec un prix équivalent.
Tu as l'Evagreen, le Syto9, le Sso7, etc. Ce sont en fait des molécules plus utilisées pour les HRM analysis mais rien n'empêche de les "détourner". Elles peuvent aussi permettre de réduire les coûts en permettant de faire quelque chose d'impossible avec le Sybr Green, des multiplex. Enfin pas en quantitatif

[piwi]

De mémoire, il me semble que l'Evagreen est bien moins cher que les autres pour une efficacité équivalente. Sans doute une option à tester plus que celle de radiner sur les quantités de Sybrgreen engagées par réaction. Après, je ne connais pas votre machine, mais sur les vieux lightcyclers Roche ou les Realplex eppendorf, on peut bosser sans problème sur des volumes réactionnels de 12.5µl, voir 10µl. Donc, en changeant de fournisseur pour le fluorophore, et en divisant le volume réactionnel total par deux voir plus, vous avez déjà un gain substantiel. Après, on ne peut pas faire ce genre de manip' avec juste de l'ADN et de l'eau. Ça a un prix qui n'est pas négligeable et qui n'est pas réductible à l'infini.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[kamor]

Il me semble que de plus en plus de gens foncent sur ces fluorophores. Mon fournisseur a même été dépassé par les commandes, si bien que la commande d'un seul kit s'était révélé problématique avant cet été


P.S. = je ne me suis pas relu avant de poster mon message précédent, je voulais écrire "Tu pourrais même te retrouver avec des amplifications aspécifiques non souhaitées. Ce qui est plus embêtant.