problème de migration de électrophorèse SDS PAGE

[chtibi houda]

Bonjour,

j'ai besoin de votre aide, j'ai un problème durant la migration du gel d'électrophorèse SDS PAGE, bon lorsque les échantillons dépassent un petit peut la moitié ou le 3/4 du gel elle résulte des ondulation dans le gel et par conséquent la migration devienne très lente ou bien vous pouvez dire qu'elle s’arrête, donc je diminue toujours le courant à 50 mA pour éviter le max possible ce problème ce qui fait la migration demande bcp de temps jusqu'a 8h, sachant que le gel est de 6 cm (mini-gel).
je ne sais pas l'origine de ce problème, j'ai vérifié les tampon et tous.

Merci d'avance pour vos réponses.
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[Flyingbike]

Quelles cuves ? Gels commerciaux ou faits mains ? Une photo ?
Quel tampon de migration ?
Je suppose un problème de tampon qui fuit

[chtibi houda]

Bonsoir,
Merci pour votre réponse.
Le gel fait mains, et le tampon de migration 1x qui est composé de glycine, SDS et Tris-HCl. Voilà une photo du gel

[Flyingbike]

est ce que votre gel est bien homogène quand vous le coulez ? vous ne voyez pas de vagues dedans ?

Les mix pour le coulage sont bien mélangés ?

vous faites bien 2 gels, un en bas à pH 8,8 et un en haut à pH6,8 ? vous attendez que le premier soit polymérisé avant de faire le second ?


Etes vous sure d'avoir suffisamment de tampon dans la cuve centrale ? De sorte à ce que le niveau de tampon soit toujours au dessus de rebord de la petite plaque ?

Pas de bulles sous le gel entre les deux plaques ?

Ca n'est pas facile de trouver la solution à distance

[A voir en vidéo sur Futura]

[chtibi houda]

Bonjour merci pour votre réponse,

Oui le gel est bien homogène, il n'existe ni vagues ni bulles dedans et les mix pour le coulage sont bien mélangés.

Oui le gel de séparation en bas de pH 8,8 et le deuxième de concentration de pH 6,8 et j'attend que le premier soit polymérisé avant de faire le second.


en ce qui concerne le tampon, je suis sure qu'il y a suffisamment de tampon dans la cuve centrale, et chaque 5 min je controle le niveau du tampon pour s'assurer que le tampon soit au dessus de rebord de la petite plaque.

Pas de bulles sous le gel entre les deux plaques ? pour cette qst je n'en suis pas sure

mais ce que j'ai pas compris pourquoi la migration est normale au début alors que lorsqu'elle atteint ce point des ondulation apparaisse dans le gel, dans un premier temps j'ai pensée qu'une augmentation de la température dans la chambre interne qui est responsable de ce problème parce que le gel s'est réchauffe et s'est déformé, j'ai déposé l'appareil d’électrophorèse dans la glace est j'ai bien contrôlé la température al'aide d'un thermomètre malgré ça le problème persiste. j'ai diminué le courant mais rien ne change.

[Flyingbike]

je ne comprends pas non plus, si tout ce que je vous ai dit a déjà été vérifié...

A vérifier encore : les solutions (leur pH et concentrations) y compris le tampon de charge



C'est dommage parce que le haut du gel est très bien. Par contre, sur l'image, vous avez coupé le gel supérieur ? parce que je ne vois pas la démarcation

[invite2eb5a45f]

Difficile à diagnostiquer comme ça, mais si ce n'est pas l'homogénéité de la solution, je parierais sur une accumulation de bulles entre les deux plaques et sous le gel effectivement. Comment évolue le voltage pendant la migration ?

Je déconseille de migrer à ampérage constant. En cas de problème de conductivité (typiquement si il y a des bulles ou une fuite de liquide), le générateur va compenser en augmentant la tension. J'ai déjà vu des plaques casser à cause du voltage qui s'emballe, voire même le caoutchouc qui sépare les deux chambres qui fond (il faut dire qu'on migre à 350W...).

En bloquant à 100V, on évite ce genre de désagrément. Et typiquement, si il y a un problème de conductivité, c'est l'ampérage qui se casse la gueule. La migration ralentit, voire s'arrête, mais il n'y a pas de danger/risque de casse. Il suffit de régler le problème et ça repart.

A savoir aussi que à fort courant (il me semble que pour moi, une migration à 100V envoie à peu près 30 mA), le gel chauffe, et ça peut foutre le gel en l'air, en particulier si vous avez eu la main lourde en APS/TEMED.



Attend... 8 heures de migration pour un gel de prot qui tourne à 50 mA ? C'est quoi ce gel de barbare ? C'est de l'acryl pure ou quoi ?!

[Flyingbike]

j'avais pas vu le temps, 8h a 50mA il y a bien un problème...

donc re vérifier les solutions, les dilutions, voire les remplacer, y compris le tampon de migration


@Tibosax sur certaines cuves, on peut migrer à 250-300V comme dans les mini protean. Ça marche aussi avec les gels maisons, et c'est pas plus moche, ca chauffe un peu mais si le gel est correct ça ne pose pas de problème et ça migre en 15 min


Dans le cas ici, il faudrait nous donner la tension de migration pour une consigne a 50mA, et nous dire si cette tension change lorsque le gel commence a se comporter bizarrement

[chtibi houda]

Bonjour je me suis déplacé à un autre laboratoire et j'ai refait la migration avec la même appareil d'électrophorèse mais avec un autre générateur. la migration est terminé après 45 min sans problème de migration voilà une photo
Merci beaucoup pour votre réponses