Bonjour,
J'ai transformé des bactéries compétentes avec un plasmide que je souhaite amplifier (résistant à l'ampiciline) et j'ai des colonies sur ma boîte.
Par contre quand je veux amplifier je n'ai rien. J'ai prélevé 4 colonies différentes que j'ai mis dans 2 et 5 ml de LB+ampiciline toute la nuit à 37°C sous agitation et le lendemain rien n'a poussé. J'ai recommencé deux fois sans succès !
Savez-vous ce que je pourrais améliorer pour enfin pouvoir amplifier ?
Merci pour votre aide
Salut,
Perso je fais l'amplification dans 100ml de milieu LB (+antibio). Si il y a trop peu de milieu, la phase de croissance exponentielle va être courte, et le lendemain tu seras même probablement dans la phase de mort bactérienne. Le second conseil que tu peux tester c'est de refaire des colonies sur une plaque LB. Si tu ré-utiles la même boite que tu gardes à 4°C, ça peut durablement baisser l'activité bactérienne, je te conseil de refaire une boite de pétri fraîche !
Si ça ne marche pas, essaye de contrôler ton expérience en faisant pousser des bactéries sans le plasmide, juste pour voir si il y a pas un problème avec ton milieu/antibio/thermostat/agitation/etc.
Bon courage
en bio mol, les contrôles sont extrêmement importants.
En parallèle des transfos avec le plasmide, prenez des bactéries non transformées et mettez les aussi sur boite. SI vous avez autant de colonies, vous avez un problème de sélection et donc quasiment aucune chance d'avoir des bactéries portant le plasmide.
Vérifiez que les concentrations d'ampicilline sont bonnes, et que vous utilisez les mêmes pour les boites et pour le milieu liquide
si par exemple vous tuez l'antibiotique en coulant vos boites trop chaudes, tout va pousser y compris les bactéries non transformées...
La vie trouve toujours un chemin
Comme ont dit blisax et Flyingbike, quitte à refaire la manip ajoutez un contrôle négatif !
Vous pouvez aussi faire une PCR sur colonie pour vérifier que votre plasmide est bien transformé dans les colonie que vous voulez repiquer ! (1 colonie dans 10µL d'eau, prendre 1µL de cette suspension pour la PCR, laissez le reste dans 50µL de LB+amp à 37°C le temps de la PCR et servez vous en pour ensemencer votre prep après).
Pour ce qui est des boîtes trop chaudes, il existe des préparation toutes prêtes de LB ampi/kana en sachet à faire fondre et couler, donc j'aurais tendance à croire que les antibio résistent au moins à la température d'ébullition du milieu à pression atmosphérique, c'est surtout à l'autoclave que ça ne passe pas (à moins qu'il y ai un ingrédient secret dans ces prep de milieu?).
