Bonjours, j'ai besoin d'aide pour un exercice, si quelqu'un pouvait m'aider
L’activité enzymatique de la créatine kinase (CK) dans le sérum est dosée selon le principe
réactionnel suivant :
Créatine phosphate + ADP => Créatine + ATP (enzyme impliqué : CK)
ATP + glucose => ADP + glucose 6 phosphate (enzyme impliqué : HK)
glucose 6 phosphate + NADP+ => 6 phospho gluconate + NADPH H+ (enzyme impliqué : G6PD)
La vitesse de formation du NADPH,H+ est mesurée à pH 6,50 et à 340 nm (coefficient d’absorbance molaire du NADPH,H+ = 6300 L.mol-1.cm-1).
Protocole opératoire :
Température : 37 °C.
Introduire dans une cuve en quartz (trajet optique de 1 cm) :
réactif A ............…... 2,4 mL
sérum ........................ 0,1 mL
Après homogénéisation, le mélange est préincubé 3 min, puis la réaction est déclenchée par :
réactif B .................. 0,5 mL
Après un temps de latence, l’absorbance est lue en continu à 340 nm (pendant 2 minutes).
La variation d’absorbance lue est en valeur absolue de 0,246.
Questions :
1) Quels sont les composés présents dans le mélange des réactifs A et B ? Quelles sont les
conditions liées à leur concentration ? Justifier le choix de la longueur d’onde et indiquer le
sens de la variation de l’absorbance.
On trouve tout les substrats cité dans le protocole (Créatine phosphate, ADP, glucose, NADP+), les enzymes sauf la CK qui est dans le sérum et un tampon pour que le PH reste à 6.5
Concernant les conditions, les substrat doivent être en excès afin de saturer les enzymes et permettre la mesure de l'activité enzymatique de la CK
La longueur d'onde choisie (340 nm) est uniquement absorbé par le NADPH H+ ce qui permet d'étudier l'enzyme CK, son sens de variation est positif puisque le NADPH H+ est un produit de réaction.
2) Quelles sont les conditions à respecter concernant la cinétique réactionnelle pour que la
mesure soit validée ?
La cinétique doit être linéaire
3) Calculer la vitesse initiale en mol/L/min dans la cuve réactionnelle.
On utilise la variation d'absorbance par minute (donc 0.123), la largeur de la cuve et le coefficient d'extinction molaire pour calculer la vitesse initiale (car elle peut être assimilé à une concentration d'activité catalytique) => V = 0.123/1 x 6300 = 19.5 x 10-6 mol.L-1.min-1
4) En déduire la concentration catalytique (en U/L et en nkat/L) de la CK dans le sérum.
Concentration catalytique = (0.123/6300 x 1) x 10^6 x 60 = 1171.2 U.L -1
Conversion en nkatal.L-1 = (1171.2 x 1000)/60 = 19520 nkatal.L-1
5) La méthode est adaptée sur un automate équipé de cuves réactionnelles dont le trajet optique
est de 0,6 cm. Calculer le facteur F de multiplication de la variation d’absorbance par 30 s
('A/30 s), permettant d’obtenir directement la concentration catalytique d’un sérum en U/L
(sachant que le facteur de dilution du sérum dans le milieu réactionnel demeure inchangé).
Quelle est la valeur du facteur F’ permettant d’obtenir les résultats en nkat/L ?
Je pense qu'il faut utiliser la même formule que dans le 4) mais il me manque des données et je ne les trouve pas ...
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