Séquencer une vingtaine de SARS-CoV-2 en même temps

[invite9c236b9b]

Bonjour,

Est-ce qu'il y a une méthode de séquençage qui permette, à partir des échantillons de 20 patients infectés, de séquencer ces 20 virus en même temps ? Nanopore est fait pour séquencer plein de gènes en même temps mais je pense qu'il faut qu'ils aient au moins un nucléotide sur 10 de différence. Pour SARS-CoV-2 la différence (du génome consensus) attendue entre deux patients c'est un nucléotide sur 10000.

En y réfléchissant j'ai l'impression qu'en théorie c'est possible (Illumina, 20 marqueurs différents, localisation de l'échantillon sur la puce...), et qu'en pratique ça peut donner des erreurs de séquençage étranges. Le suspect c'est le labo néerlandais qui a posté 165 séquences en une semaine. Il y a une méthode connue pour faire ça ?

Peut-être un système de primers/electrophorèse qui détecte la localisation des quelques mutations qu'on peut ensuite expliciter par séquençage Sanger avec des primers faits pour amplifier cette petite région ?

Sinon j'aimerais bien connaître les différents types d'erreur de séquençage auxquels on peut s'attendre. Pour nanopore je sais que la partie algorithmique pour reconstruire le génome (à partir de millions de données hyper bruitées) est presque plus complexe que l'outil de physico-biochimie en lui-même.
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[invite9dc7b526]

oui il y a des machines qui peuvent séquencer plusieurs échantillons simultanément. Dans mon labo on a une qui traite 16 échantillons en parallèle mais il en existe qui ont une capacité plus grande (au moins 96, peut-être plus).

[invite9c236b9b]

C'est basé sur quoi comme technologie ? C'est une même machine dupliquée 96 fois, ou il y a une astuce technique qui permette de paralléliser ?

[Flyingbike]

Le barcoding

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9dc7b526]

je pensais au séquençage classique ou il s'agit en effet de machines dupliquées. Avec le séquençage haut débit une machine peut en un passage (un "run") produire des dizaines de millions de séquences. Mais il s'agit de séquences relativement courtes. Je ne sais pas où on en est parce que ça évolue très vite mais ça doit être de l'ordre de 200 paires de bases ou un peu plus. Si ça t'intéresse tu trouveras des explications en cherchant "high throughput sequencing" ou bien "next generation sequencing".

[Flyingbike]

En nanopore les rends peuvent faire plusieurs mégabases.


En ajoutant des barcodes spécifiques aux différents échantillons, on peut les séquencer en multiplex et ensuite les identifier grâce au barcoding

[invite9c236b9b]

Merci, c'est l'idée que je cherchais.

[invite9c236b9b]

J'ai regardé les Pays-Bas ont bien mentionné Nanopore dans les séquences qu'ils ont posté. Parce contre ils n'ont pas précisé barcoding, pas très sympa de leur part.

Pour les Pays-Bas qui séquencent presque tous les voyageurs infectés ils ont mis Illumina Miseq

donc toujours pas de mention de barcoding/multiplex

https://emea.illumina.com/science/te...equencing.html

[invite9dc7b526]

Parce contre ils n'ont pas précisé barcoding, pas très sympa de leur part.

pourquoi? qu'est-ce que ça peut faire qu'ils aient utilisé une méthode ou une autre. Toutes les technologies NGS utilisent ce principe de marquage des échantillon avec un "tag" constitué d'une dizaine de nucléotides (le code barre).

[invite9c236b9b]

Je ne sais pas, je n'arrive pas à trouver d'explication claire de ce que fait nanopore sur un exemple simple et réaliste.

En théorie ça n'est pas du tout pareil de séquencer en même temps (10^5 copies) de 50 brins d'ADN très différents ou de 50 brins d'ADN presque identiques.

Et comme au départ on a très peu de copies du génome du virus on va d'abord l'amplifier par RT-PCR en utilisant des amorces qui vont amplifier des morceaux de 500 ou 1000nt qui se recouvrent, les séquencer tous en même temps, et calculer leurs consensus et les recoller sur ordinateur. Il n'y a pas besoin de barcode là surtout quand on dispose de la séquence référence qu'on sait différer au maximum de 20 nt de notre virus.
Dans ce scénario on n'a pas besoin de reads longs, des reads de 50nt suffisent, ils se recouvriront et on saura où les placer en regardant le génome référence.

Si on veut séquencer 20 virus en même temps alors on peut faire les 20 RT-PCR séparément, puis intégrer un barcode différent dans chaque réaction, puis les mélanger et les séquencer toutes en même temps, et isoler quelle séquence vient de quel patient sur ordinateur à la fin. Dans ce scénario on a besoin d'avoir des read longs, de plus de 500nt, qui contiennent à la fois le barcode et la mutation située 500nt plus loin.

[invite9c236b9b]

J'ai l'impression qu'ils utilisent des barcodes soit pour le multiplexing soit pour séquencer beaucoup de gènes, pour savoir quand finit un brin, par exemple pour différencier AAAAAAAAAAAAAA de AAAAAAAAAAAAAAAAAA (le barcode c'est une petite séquence de nucléotides qu'on ajoute au début et à la fin du double-brin d'ADN avec une ligase)

Pourquoi je n'arrive pas à trouver d'explication simple en quelques mots de ces concepts / prérequis pour décoder les documents techniques tels que le protocole pour séquencer SARS-CoV-2 avec MinION nanopore ? Cette idée de repérer les débuts/fins des "reads" est mentionnée ici, mais c'est difficile de se faire une idée sans un modèle jouet des données bruites générées par MinION.

[invite9c236b9b]

Avec le multiplexing et le séquençage de plein de gènes il y a un 3ème scéranio qui semble encore plus compliqué : c'est séquencer les différentes variantes de SARS-CoV-2 mélangées dans un même échantillon, car les mutations qui viennent d'apparaître durant l'infection d'un patient ne sont présentes que dans tant de % de ses virus.

On doit pouvoir séparer ces variants mais seulement en faisant des passages dans des Vero cells, ce qui introduit de nouvelles mutations. Donc il faut éviter.

L'algorithme de nanopore est fait pour éliminer les variants trop peu nombreux, considérés comme des erreurs de séquençage. Il doit donc falloir utiliser tous les outils à disposition (dans la manière d'amplifier la séquence et d'ajouter des barcodes) pour différencier ce qui est une erreur de séquençage de ce qui ne l'est pas.