Récupérer un gène pour faire du clonage
Bonjour à tous!
Après avoir longuement regardé sur internet je ne trouve pas de réponse précise, alors je me lance pour la présenter ici :
Je dois extraire un gène d'un organisme en culture. Je ne vois pas comment faire pour obtenir seulement ce gène.
En réalisant une extraction d'ADN, je vais récupérer tous l'ADN de la cellule, or je ne veux qu'un seul gène
Si jamais quelqu'un a la réponse
c'est simple : PCR ou synthèse de gène
La vie trouve toujours un chemin
Mais après la PCR tu fais quoi ? Tu n'auras pas isolé ta séquence de gène, seulement amplifié tous ton ADN
Eh bien il faut amplifier le gène et rajouter des sites de restriction pour le cloner
La vie trouve toujours un chemin
Donc tu ferais une extraction d'ADN, puis une PCR pour amplifier le génôme. Mais à ce moment là tu possèdes l'ensemble du génome, il faut extraire le gène pour qu'on ne récupère que la séquence d'ADN qui nous intéresse.
Je ne comprend pas comment on obtient notre séquence toute seule.
Aucun problème pour les étapes qui suivent, c'est juste celle là que je ne comprend pas
Non, on ne peut pas faire de PCR pour amplifier le génome
Il faut faire une PCR avec des amorces situées de part et d'autre du gène d'intérêt. Encore que si l'organisme en question fait partie de ceux qui ont des introns, il faut partir de l'ARN et non de l'ADN génomique, si le but est de faire un clonage d'expression.
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Désolée je reprend le but du sujet :/. On possède (informatiquement) une séquence de gène et uniquement la séquence du gène (d'origine bactérienne). Le but final est d'intégrer cette séquence dans un plasmide pour obtenir des bactéries recombinantes et produire la protéine.
Une des questions est d'expliquer la manière dont on récupère le gène pour les clonages sachant que l'on dispose de tous les organismes d'origine en culture. C'est tout le processus que je ne comprend pas ... désolée j'ai mal présenté ma question au départ.
Avec ce que vous dites et ce que je comprend, il faudrait récupérer l'ARNm de la séquence ? Mais comment faire ?
Bonjour,
Il existe des kits pour récupérer l'ensemble des ARNm
Une fois les ARNm récupérés il faut transformer ces ARNm en ADN puis amplifier l'ADN par PCR avec des amorces spécifiques de ton gène d’intérêt (vu que tu as la séquence sur l'ordi c'est facile à faire). L’ideal c'est d'ajouter des sites de restriction sur tes primers (identiques à ceux de ton plasmide dans lequel tu veux cloner ton gène)
Ensuite après ta PCR tu fais un clonage classique et voilà
si c'est bactérien, on peut faire la PCR sur de l'ADN génomique puisque pas d'introns. Il suffit de dessiner un couple d'amorces qui encadrent le gène cible, en rajoutant de chaque coté des sites de restriction pour faciliter le clonage ultérieur. Ces sites seront à choisir en fonction de différents critères notamment en fonction des sites disponibles dans le MCS du vecteur cible.Envoyé par Rivail
Il est dans tous les cas plus simple (et éventuellement moins cher selon les cas) de commander directement le gène synthétisé avec les sites directement ajoutés, voire cloné directement dans le bon vecteur.
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des collègues à moi font ça. Effectivement ils font synthétiser l'ADN par une boîte qui est spécialisée dans ce travail. Il faut penser à "éditer" la séquence pour la rendre compatible avec l'organisme qui va ensuite synthétiser la protéine. En effet chaque organisme a ses préférences pour tel ou tel codon parmi les codons synonymes (c'est ce qu'on appelle le "biais de codon") et si tu ne lui donnes pas les codons qu'il aime, le rendement en protéine peut être très faible.
Alors effectivement je n'avais pas vu que c’était la bacterie l'organisme de depart donc c'est directement plus simple de faire une PCR sur l'ADN genomique comme le disait Flyingbike
Mais la synthese de gene reste clairement la meilleure methode pour gagner du temps.
Et du coup pas besoin d'optimisation des codons comme le propose minushabens vu que c'est bactérie au debut et bacterie a la fin
Aaah d'accord c'est bon j'ai compris, je crois. En fait ma séquence je la sépare de l'ADN génomique simplement avec des enzymes de restrictions et je l'amplifie par PCR avec des amorces spécifiques. Ce n'est pas grave s'il reste des fragments du génome (parce que même si je n'amplifie que ma séquence d'intérêt il y a encore le reste d'ADN) ?
oubliez l'ARN
la PCR se fait directement sur le génomique. Le produit de PCR n'est en théorie que votre gène cible. C'est le produit de PCR qu'on digère avec les enzymes. Il faut commencer par la PCR
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Tu peux directement faire la PCR sur l'ADN genomique, pas besoin d'utiliser d'enzyme de restriction au depart
Pour la bacterie il est plus judicieux d'utiliser l'ADN genomique
L'utilisation de l'ARNm est utile pour les cellules animales vu que ca permet de ne recuperer que la sequence codante, ce qui simplifie pas mal les choses
Okai je vois merci beaucoup à vous tous!! J'aurai vraiment aimé pouvoir synthétiser directement le plasmide avec l'insert mais bon je suis obligée de faire toutes les étapes moi-même :'( (mais je vais proposer cette solution à la fin de mon compte rendu, merci
Juste petit détail, quand vous parlez d'enzymes ce sont lesquelles exactement ?
Bah celles qui sont dans ton plasmide final, que tu utilises pour le lineariser et faire la ligation avec ton insert d'interet (gene)
Il y a un détail qui me chiffonne toujours ... si on prend tout l'ADN génomique, même si on amplifie que notre séquence par PCR, à la fin on aura notre séquence amplifiée attachée à l'ADN génomique non ? Je n'arrive pas à visualiser comment on ne peut obtenir que notre séquence si on garde tout l'ADN génomique
"Bah celles qui sont dans ton plasmide final, que tu utilises pour le lineariser et faire la ligation avec ton insert d'interet (gene)"
Ah oui okai mais ça c'est bon j'ai compris
Elle reste pas attachée a l'ADN genomique
Apres pour te debarasser de ce dernier tu peux faire un traitement avec l'enzyme DpnI, puis separer les produits sur gel d'agarose et extraire le fragment d’intérêt a partir de ce gel
Ah oui c'est bon je viens de comprendre ... Désolée je suis perdue dans ce projet ahah.
Que fait l'enzyme DpnI en particulier ? J'ai regardé sur internet et ça semble être une enzyme de restriction qui reconnaît des motifs méthylés ... Je n'ai jamais utilisé cette enzyme
On ne peut pas faire directement un gel d'agarose pour extraire notre séquence ?
DpnI va digerer l'ADN genomique bacterien, ce qui va "nettoyer" ton echantillon
Tu peux directement charger tes echantillons sur gel apres PCR mais du coup tu auras toujours ton ADN genomique bacterien dans ton echantillon
Tu saurais expliquer plus en détail ? Comment cette enzyme ne peut digérer que l'ADN génomique et pas la séquence d’intérêt amplifiée?
Oui mais notre séquence étant beaucoup plus petite migrera plus loin, on pourrait facilement la reconnaître non ?
Désolé pour la reponse tardive
Pour l'enzyme DpnI elle ne reconnait que l'ADN bacterien car il est méthylé, ton ADN amplifié par PCR lui ne l'est pas et ne sera donc pas dégradé
Pour le gel, oui ta sequence migrera plu loin, mais je ne sais pas si charger l'ADN total bacterien sur gel donne un resultat correct ou pas (je fais toujours un traitement DpnI apres PCR)
Je ne suis pas sûr de l'intérêt du traitement enzymatique. Une PCR avec 1ng d'ADN bactérien, déposée sur gel, on ne sera de toute façon pas emmerdé par le matériel de départ...
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C'est une etape que je fait toujours, mais j'utilise toujours plus que 1 ng d'ADN au depart
il y a peut être une dimension culturelle en fonction du labo
Sur une PCR qui fonctionne bien, on peut partir avec moins de 1ng, ou même 10ng, ca ne pose pas de problème pour la migration. Si on purifie le produit sur gel, on se débarrasse de toute façon de la matrice. Mais effectivement, ca dépend de la PCR, de la technique d'extraction, etc....
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Oui je pense que c'est plus culturel qu'autre chose !
Je comprends très bien ton point de vue, et ça fonctionnera parfaitement
