Conservation de l’ADN

[invited6d09dd8]

Bonjour à ceux qui me lise actuellement.
Je lance le sujet de la conservation de l’ADN d’une manière générale car j’aimerais conserver de l’ADN sur du long terme et le mieux possible et je ne sais pas forcément comment m’y prendre.

En me renseignant , j’ai pu voir que l’ADN était conservé entre -20 et -80 la plupart du temps ou qu’il était maintenant également stocker à température ambiante.

Je parle en tant que particulier , je n’est pas de laboratoire etc , comment s’y prendre et quel méthode choisir pour stocker de l’ADN chez soit de la meilleure façon et lui assurer la meilleure conservation possible dans le temps ? C’est un sujet plutôt vaste mais j’espère pouvoir échanger pour en savoir plus là dessus.

Merci
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[Flyingbike]

Il y a plusieurs facteurs à prendre en compte

-la température, le plus froid est le mieux MAIS la décongélation/congélation est très délétère et pour les opérations répétées il vaut mieux stocker à 4 pendant un mois, par exemple, que de décongeler 5 fois un tube.
-le tampon : l'ADN se conserve mieux dans une solution tamponée et chélatée, le classique étant le TE (Tris EDTA)
-la nature de l'ADN : de l'ADN génomique double brin se conserve mieux que des polynucléotides par exemple
-la méthode d'extraction : plus c'est propre, mieux c'est

Tous ces facteurs peuvent jouer, mais il faut également prendre en compte la finalité de la conservation : si c'est pour séquençage direct, clonage, etc., c'est assez sensible. Si c'est pour faire de la PCR, la redondance et l'amplification spécifique masquera fortement les éventuels dommages dus à la conservation.

[MissJenny]

Je parle en tant que particulier , je n’est pas de laboratoire etc

donc tu ne sauras pas extraire l'ADN et en réalité ce que tu veux conserver c'est des tissus ou cellules. Tu penses à quelle durée? (long terme c'est vague).

[Flyingbike]

On peut extraire de l’ADN à domicile sans difficulté.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited6d09dd8]

Que veux tu dire par "c’est assez sensible" ? Moi j’aimerais principalement conserver mon adn pour plus tard , c’est à dire dans 10 ans , 20 , 30 , 70 ans , j’aimerais faire des archives de mon adn , actuellement j’ai surtout la possibilité de stocker à température ambiante donc une température qui n’est pas très stable à l’année selon les saisons etc Mais est que c’est une bonne démarche ? Au passage j’ai vu qu’une société nommée imagine ( je croit) avait développé des capsules (DNAshell) faite sûrement d’un alliage de métaux et qui cible l’objectif de conserver l’ADN à température ambiante de manière "durable" pour éviter le stockage à basse température et ses problématiques , mais ce n’est pas accessible au particulier et pas évident d’en savoir +
Au passage Merci à ceux qui m’ont répondu !

[Flyingbike]

vous n'avez pas précisé comment vous extrayez l'ADN, ni ce que vous vouliez en faire.


Une piste pour vous serait de faire du stockage à sec, c'est très utilisé pour l'ADN plasmidique, où on dépose de l'ADN en solution sur un buvard, le buvard sèche, et l'ADN ne bouge pas pendant des années. Pour le réutiliser, on met le buvard dans de l'eau.

J'ignore si cela est aussi efficace sur de l'ADN génomique.

[invited6d09dd8]

Pour l’extraction de l’ADN , je ne sais pas encore et pour ce qui est de ce que je compte en faire , je cherche surtout à le conserver pour plus tard , pour du séquençage. Si j’ai bien compris la problématique , l’ADN ne peut pas être conserver de manière parfaite sans dégradation ? Et le séquençage devient devient plus hasardeux à l’avenir

[Flyingbike]

Encore une fois, même pour le séquençage il y a beaucoup de paramètres. Si vous voulez faire un séquençage génome entier, ou ciblé, si vous avez beaucoup de matériel ou pas, selon la technique de séquençage utilisée.... La dégradation de l'ADN sera plus ou moins problématique.

[MissJenny]

Je ne vois oas trop l'intérêt de conserver l'ADN 50 ans pour le faire séquencer au bout de ces 50 ans. Autant le faire séquencer aujourd'hui.

pour ce qui est de l'extraction, quand je disais que ça n'était pas possible hors d'un laboratoire de biologie, je pensais à l'extraction d'un ADN intact, purifié et sans contamination par de l'ADN d'autres organismes. Obtenir de l'ADN "sale" est facile. Mais ensuite le séquençage risque d'être problématique.

[invited6d09dd8]

D’accord je vois , au niveau du matériel ( pour le moment uniquement le matériel en lien avec le prélèvement et la conservation de l’ADN) de quoi ai je besoin ? Je vais pouvoir y réfléchir une fois que j’aurais des pistes d’achat.

[invited6d09dd8]

Bonjour missjenny , en réalité j’ai juste pour projet de faire une "archive" avec des prélèvements réguliers de mon adn , pour pouvoir étudier mon génome et son évolution plus tard. Sauf si il était envisageable de faire des séquençage de suite et de les conserver mais je ne pense pas que se soit accessible à un particulier.
Comment bien s’y prendre pour ne pas avoir d’ADN "sale" ?

[Flyingbike]

alors juste comme ça, dans les grandes lignes, votre génome n'évolue pas.

Et ne pensez pas qu'une fois séquencé, l'analyse des résultats est à la portée de n'importe qui.

[MissJenny]

Oui, à moins de prélever des cellules d'une tumeur cancéreuse et de les séquencer, il ne va pas y avoir de modifications notables du génome. Quelques rares mutations ponctuelles, les télomères qui raccourcissent paraît-il (mais je ne sais pas si on les séquence).

Et Flyingbike a raison, assembler un génome et l'annoter demande des compétences assez pointues (quoiqu'on puisse imaginer qu'on aura un jour des logiciels qui le font automatiquement).

Le plus raisonnable est d'envoyer un prélèvement à une boîte comme 23 and me qui fait ça en routine, et renvoie une liste des mutations d'intérêt médical, plus quelques informations sur tes origines familiales. Par contre ces entreprises gardent tes données pour on ne sait quel usage...

[Flyingbike]

NB : les tests ADN "récréatifs" ont un statut illégal en France

[invited6d09dd8]

Pour essayer d’explorer un peu plus le sujet , le génome n’évolue pas ? ou bien on n’en est pas certains actuellement ? je pense notamment à la partie "non codante" , qui peut être "évolue" beaucoup au cours de la vie d’un être vivant ? Même si je croit que actuellement le sujet est plutôt flou

[MissJenny]

chaque fois qu'une cellule se divise il y a des erreurs de copie de l'ADN, en d'autres termes des mutations. Mais pas beaucoup, moins de 10 je crois, sur les 3 milliards de paires de bases. Il n'empêche qu'ente deux cellules prises au hasard dans ton corps il y a quelques dizaines de mutations de différence. Quand tu séquences ton génome, en réalité tu séquences l'ADN d'un certain nombre de cellules. En une position donnée sur le chromosome, il pourra y avoir 2 (rarement plus) nucléotides différents, mais en général un seul très majoritaire, c'est celui qui sera gardé dans la séquence dite "consensus" qui sera considérée comme représentative de ton génome. Ca c'est dans le cas d'un locus homozygote. Pour un locus hétérozygote tu pourras avoir 2 nucléotides présents dans des proportions d'environ 50/50.

Si tu séquences à nouveau ton génome quelques années plus tard, de nouvelles mutations pourront être présentes mais elles seront éliminées du génome assemblé. Il faut en effet savoir que la méthode de séquençage (et aussi la phase d'amplification qui la précède) produit des mutations artificielles. Donc en présence d'une mutation rare, on ne peut pas savoir si elle est réellement présente dans tes cellule ou si c'est une erreur de séquençage, c'st pourquoi on élimine ces mutations rares.

tout ça pour dire que tu ne verras pas évoluer ton génome au cours de ton vieillissement (hors cancer).

[invited6d09dd8]

Missjenny merci pour ta réponse , je précise juste que quand j’ai utilisé le mot évoluer , je pense surtout côté dégradation du matériel génétique. En réalité vu ce que j’avais pu lire en me renseignant j’étais partie sur le fait que si il y a vieillissement , c’est en bonne partie liée à la dégradation du matériel génétique , mais en réalité ce n’est pas lisible au niveau du génome. J’ai une question , quand on parle de séquençage , on pense à la molécule d’ADN qui est donc dans toutes nos cellules , mais selon l’endroit du corps d’un être vivant ou l’on a prélevé la molécule d’ADN , le résultat du séquençage est "identique" sauf en cas de tumeur comme tu me l’as expliqué , malgré le fait que comme tu as dit "Quand tu séquences ton génome, en réalité tu séquences l'ADN d'un certain nombre de cellules" est ce que ça sous entends que pour savoir exactement ce que nous sommes à une date A ou B par exemple il faudrait séquencer un très grand nombre de cellules voir même l’intégralité de nos cellules ? Je vulgarise pas mal mon vocabulaire mais c’est pour éviter d’employer des mots que je ne connais pas ou peu et pour la clarté de mes textes.

[MissJenny]

pour séquencer l'ADN d'un cellule il faut la détruire, donc on ne peut pas séquencer toutes les cellules d'un organisme sans le tuer. Mais comme je disais plus haut les génomes de nos cellules sont presque identiques, donc ça ne servirait à rien. Chez les femmes il y a une particularité : seul l'un des deux chromosomes X est actif, et ce n'est pas toujours le même selon les régions du corps. Donc on pourrait s'amuser à chercher lequel est actif en prélevant un échantillon de chaque organe par exemple. Mais bon...

je ne sais pas si le vieillissement est lié à des modifications du génome. Je parierais plutôt pour des différences dans l'expression des gènes, laquelle expression est sous le contrôle de signaux cellulaires, lesquels dépendent des cellules qui sont présentes dans le corps à tel âge, ce qui peut varier puisque les cellules meurent et sont plus ou moins renouvelées.

[Flyingbike]

Il y a bien le raccourcissement des télomères avec le vieillissement, mais ce sont des régions complexes qu'il est difficile de séquencer en même temps que le reste.


En résumé, la discussion est un peu vague car le demandeur semble un peu tout mélanger. Comme cela a été soulevé par MissJenny, étudier des modifications rares et aléatoires sur des génomes entiers est très complexes, car on doit faire (pour simplifier) un compromis :

-soit on veut faire du séquençage non ciblé, long range,
-soit on fait du séquençage ciblé, mais dans ce cas là on sait à peu près ce qu'on cherche

Dans le premier cas, on ne pourra pas séquencer des cellules uniques car sans amplification il faut du matériel au départ. Et dans ce cas, une mutation unique sera noyée dans le signal des autres séquences non mutées.
Les nouvelles techniques type Nanopore permettent de séquencer des centaines de kb en une fois, mais la contrepartie cette fois est un haut taux d'erreur (plusieurs %), et dans ce cas on ne discernera pas les variants des erreurs de séquençage.

Dans le second cas, on pourrait très bien séquencer des cellules uniques, mais il faut passer par une PCR et donc cibler les régions qui nous intéressent au préalable.

(ceci reste assez schématique, mais cela donnera peut être des billes à Pommepi pour avancer)

[Deedee81]

Salut,

Une question me turlupine.

Si on veut étudier la variation du génome au cours du vieillissement, pourquoi pas (j'ai déjà lu ce genre d'étude pour le cancer, pas sur 50 ans évidemment !)

Mais quel inétérêt de conserver l'ADN ??? On séquence un échantillon tous les x temps et c'est tout, non ?

Si on est amateur le plus simple est sans doute de faire un prélèvement avec les kits habituels et de demander un séquençage complet (mais faut préparer son portefeuille !)

[invited6d09dd8]

Pour répondre à deedee81 , la conservation de l’ADN n’as peut être aucun interêt si l’on fait le séquençage de suite , mais je n’aime pas trop l’idée du kit même si c’est une piste.

[invited6d09dd8]

J’ai bien lu toutes vos dernières réponses , d’après nos échange , la conservation de l’ADN sur une longue durée à l’air hasardeuse et sûrement encore plus en pratique pour un débutant comme moi. Je n’abandonne pas l’idée mais je la laisse de côté.
On me conseille plutôt de me tourner vers un séquençage direct sans conservation , en passant par un service qui fait le séquençage à ma place ou la deuxième option , le faire moi même. Le faire soi même est t il envisageable bien que plutôt difficile et coûteux ?

[Flyingbike]

Séquencer soi même ? Même les labos sous-traitent à des entreprises spécialisées, la plupart du temps.

Quant à le faire faire ? C'est presque aussi irréaliste : il faut savoir ce qu'on cherche, où alors vous avez raté ma réponse 19.


Cette discussion sent le sapin.

[Deedee81]

Salut,

Pour le kit c'était juste pour le prélèvement, c'est quand même pratique. Il n'y a pas de raison de chercher des complications. Tu peux aussi arracher des poils/cheveux (il faut le bulbe) Pour les prises de sang c'est à faire par un professionnel : à cause des risques (caillots, infections...). Un prélèvement de peau est plus facile mais il faut plus que la couche supérieure et ça peut être douloureux et faut bien désinfecter. Et les autres tissus, hé bien il n'y a qu'une solution : le bistouri ou à la limite parfois de l'endoscopie => hopital.

Pour le séquençage à faire soi-même, il est facile de se rappelle la saga du génome humain :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Projet...ain#Historique

Au début du séquençage, cela se faisait avec des techniques traditionnelles, techniques PCR, découpage ADN, etc. Et ça allait très lentement. On annonçait la fin du séquençage vers le milieu du vingt-et-unième siècle !!!! Et ça nécessitait quand même des labos costauds avec des réactifs pas toujours faciles à se procurer ou à créer (comme les enzymes de restriction), des colonnes de chromatographie etc...

Cela s'est accéléré grâce aux machines de séquençage automatique. Ce genre de machine coûte une petite fortune. Compte minimum en centaine de millier d'euros. Par exemple, il y a deux ans un labo juste à coté de chez moi était tout fier de présenter à la RTBF son séquenceur ADN (forcément, quand ça coute aussi cher, on est fier de l'avoir, on avait connu la même chose avec les premiers IRM et les spectromètres de masse). Afin de mieux diagnostiquer les maladies. Et le prix d'un séquençage est de 1000 € (on trouve nettement moins chers sur le net mais je doute que ce soit des séquençages complets ou je doute du sérieux/qualité mais c'est possible s'ils ont énormément de clients).

Tu as donc trois possibilités :
- tu es riches, tu te paies le matériel de labo nécessaire et tu prend quelques dizaines d'années pour un séquençage
- tu es TRES riches et tu achète une machine de séquençage
- Tu prépare quelques centaines d'euros par séquençage à commander à des sociétés spécialisées, ça c'est réalisable à condition d'y mettre le prix mais sans devoir être très riche

Un conseil général : quand tu as une idée, un projet, un rêve .... (et on en a tous) : il ne faut pas te poser tout de suite la question "comment faire", il faut d'abord se poser la question de "est-ce réalisable et sinon pourquoi (difficulté, prix)"
Il n'y a rien de plus triste que de se lancer dans un projet irréalisable : ça laisse un goût d'amertume d'avoir passé du temps, des efforts et de l'argent.... pour rien.

[invited6d09dd8]

Peut être que dans un avenir "proche" les prix des appareils en lien avec le séquençage vont devenir beaucoup plus accessible. Deedee81 ta dernière réponse était un bon résumé des possibilités je trouve , au final je suis d’accord avec ce que tu dit mais je savais déjà dans quoi je mettais les pieds pour le séquençage d’où mon idée de base de ne faire que des prélèvements adn que j’aurais conserver pendant un certains temps. Pour donner des nouvelles je pense faire mon projet de cette façon : faire appel à des sociétés pour le séquençage , même si effectivement les sites qui propose ces services ont l’air d’être plutôt focalisés sur les origines ethniques et les maladies. Sinon j’avoue qu’en parallèle j’ai toujours envie de faire des prélèvements adn et de les conserver du mieux que possible mais j’avoue que certaines réponses m’ont un peu découragé notamment sur la partie où l’ont as dit que ce n’était pas possible de faire une extraction "propre" sans laboratoire.

[Deedee81]

Salut,

Peut être que dans un avenir "proche" les prix des appareils en lien avec le séquençage vont devenir beaucoup plus accessible.

Faut pas trop rêver. Une baisse des prix n'est pas impossible. Mais un appareil aussi complexe que ça a couté, coute et coutera toujours très chers. Au mieux, les machines se complexifient encore et restent à prix sensiblement égal (regarde les PC et les voitures. Une voiture moderne n'est pas meilleur marché qu'une Ford T).

Par contre le séquençage en faisant appel à des sociétés pourrait baisser de prix si ça se généralise. Mais impossible de dire si oui et quand.
Si on fait appel à une telle société il faut bien vérifier ce qu'ils font. La plupart ne font pas réellement du séquençage mais utilisent la technique PCR et des enzymes de restriction pour isoler juste certains gènes. C'est ce qu'on fait en criminalistique ou comme tu l'as dis pour voir les origines ethniques, les maladies, ou même des tests de paternité.... Dans tous ces cas on n'a pas besoin de lire un milliards de bases.

Maintenant, pour ce qui est de faire un prélèvement et conserver de l'adn, je ne peux que te conseiller de te jeter à l'eau et d'essayer : c'est sans danger, c'est instructif et c'est en forgeant qu'on devient forgeron

[Flyingbike]

Peut être que dans un avenir "proche" les prix des appareils en lien avec le séquençage vont devenir beaucoup plus accessible. Deedee81 ta dernière réponse était un bon résumé des possibilités je trouve , au final je suis d’accord avec ce que tu dit mais je savais déjà dans quoi je mettais les pieds pour le séquençage d’où mon idée de base de ne faire que des prélèvements adn que j’aurais conserver pendant un certains temps. Pour donner des nouvelles je pense faire mon projet de cette façon : faire appel à des sociétés pour le séquençage , même si effectivement les sites qui propose ces services ont l’air d’être plutôt focalisés sur les origines ethniques et les maladies. Sinon j’avoue qu’en parallèle j’ai toujours envie de faire des prélèvements adn et de les conserver du mieux que possible mais j’avoue que certaines réponses m’ont un peu découragé notamment sur la partie où l’ont as dit que ce n’était pas possible de faire une extraction "propre" sans laboratoire.

Je pense que finalement vous faites une fixation sans prendre compte des messages qui vous sont adressés.


Je vous ai pourtant expliqué que "séquencer de l'ADN" ne veut strictement rien dire, tant il existe de façons et de techniques pour le faire. Vous n'avez en fait aucune idée de ce que vous voulez faire, et encore moins de la méthode à employer pour analyser les éventuels résultats que vous pourriez avoir.

Inutile de se fatiguer à essayer de vous expliquer, donc.

[Deedee81]

analyser les éventuels résultats que vous pourriez avoir.

Et moi j'oubliais cette étape.... cruciale ! Merci !

Si on reçoit une base de données de plusieurs gigabytes avec le séquençage.... faut encore l'analyser. Si on compte que des modifications peuvent se produire dans de l'adn non codant (et ne produisant aucun arn et ne participant pas à la structure de l'adn ou à la régulation), bêtement comparer deux séquençages sans analyse approfondie.... ça n'a aucun intérêt.

EDIT sans compter l'épigénétique dont on sait qu'elle a une grande importance, d'ailleurs l'adn d'une cellule de foie et de coeur se distinguent par ça au niveau génétique, et ça, pour le séquencer : je ne sais même pas si on peut le faire en le demandant à une société. Je présume que la méthylation de l'ADN c'est pas si facile à "séquencer" (sans compter d'autres facteurs épigénétiques comme la présence de certaines enzymes liées à la régulation .... et je dois en ignorer : l'enroulement sur les histones joue-t-il un rôle épigénétique ??? Je ne sais pas).

[invited6d09dd8]

J’ai lu vos réponses et c’est vrai que vous avez raison et que c’est un vaste sujet avec des zones d’ombres mais en réalité pour m’expliquer sur ce "projet" de faire une archive de mon adn avec des prélèvements "au fur et à mesure". C’est vrai je ne sais pas ce que je vais faire et il y a des grande chance que mon projet n’ai aucun intérêt mais j’aimerais quand même le mettre en place , je cherchais juste à voir comment le mettre en place mais c’est vrai que si ce projet ne m’est que très peu accessible tant pis je ferai au mieux.

[invited6d09dd8]

D’ailleurs deedee81 quand tu dit "sans compter l'épigénétique dont on sait qu'elle a une grande importance, d'ailleurs l'adn d'une cellule de foie et de coeur se distinguent par ça au niveau génétique, et ça, pour le séquencer : je ne sais même pas si on peut le faire en le demandant à une société." Je comprends ce que tu écrit mais de toute manière une cellule du cœur n’est pas accessible au prélèvement sauf peut être dans certains cas mais je ne suis pas sure.