Transcription in vitro

[nc98]

Bonjour,

Je suis en 2eme de DUT et je travaille sur un projet sur le VHC. J'ai un peu de mal avec certaines notions de biologie moléculaire.
J'essaie de créer le protocole pour obtenir l'ARN génomique du VHC pour transfecter des cellules avec.
J'ai décidé de partie d'un vecteur pMX contenant l'ADNc du clone JHF-I du VHC et de le transférer dans le vecteur d'expression pSF-T7.
(Je ne suis pas sûre d'avoir choisi les bons vecteurs. Je recherchais juste un vecteur de base pour commander l'ADNc et un vecteur pour la transcription l'ADNc in vitro).
La seule enzyme de restriction que je trouve qui soit à la fois dans ces 2 vecteurs et bien comprise entre le promoteur et le terminateur de pSF-T7, et pas dans ma séquence d'ADNc, c'est EcoRI. Il y a également PcaI qui est présente dans les 2 vecteurs et pas dans l'ADNc, mais il se situe après le terminateur T7. Est-ce que cela pose un problème si je fais disparaître la séquence de terminaison de la transcription en utilisant PcaI, si par la suite je linéarise pSF-T7 en coupant à l'extrémité 3' de ma séquence d'ADNc avec pcaI ?
Par ailleurs, si je n'utilise que EcoRI, qui à mon sens pose les problèmes de voir le pSFT7 se refermer sur lui-même ou d'insérer la séquence dans le mauvais sens, est-ce que j'ai quand même besoin de linéariser pSFT7 avant la transcription ? J'ai vu des articles où le vecteur est linéarisé avant transcription, mais je ne suis pas certaine de l'utilité, hormis celle que l'hypothèse que j'ai faite juste avant sur la terminaison de la transcription.

Merci !
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[nc98]

Re-bonjour,

J'ai trouvé ma réponse sur un autre fil de discussion au sujet des problèmes d'enzyme de restriction et de linéarisation du vecteur, mais je ne peux pas modifier mon message.

Je reste juste embêtée par le choix de mes vecteurs, est-ce que pMX est bien le vecteur standard dans lequel est fourni la séquence commandée ? Et est-ce que pSF-T7 est un bon vecteur pour la transcription in vitro ? Je m'y perds avec les multitudes de vecteurs disponibles sur les sites commerciaux. Est-ce que vous connaîtriez un site qui rassemble les différents types de vecteur ?

Merci.

[Flyingbike]

C'est loin pour moi, mais il me semble que la transcription in vitro se fait sur vecteur linéaire, oui.
Pour le choix du vecteur, vous avez commandé un gène synthétique ? Normalement, vous pouvez choisir un vecteur, rajouter des sites de clonage, etc.
Cela dépend du fournisseur.

Pour votre question digestion, c'est un peu obscur comme ça à froid, mais vous pouvez éviter la recircularisation en déphosphorylant après digestion.

Pour l'insertion non orientée, vous aurez statistiquement moitié d'insertions à l'envers, mais il faut dans ce cas définir une stratégie de sélection des clones.

Pour cela, il faut idéalement une enzyme qui coupe à la fois le vecteur et l'insert, mais pas au milieu de l'insert. EN fonction de la taille de votre produit de digestion vous saurez s'il est dans le bon sens.

[nc98]

Merci pour votre réponse.
J'ai finalement utilisé 2 enzymes différentes en 5' et 3' de l'insert, puis je linéarise le vecteur en 3' de l'insert pour la transcription.

[A voir en vidéo sur Futura]