Normaliser les données

[jujutou]

Bonjour,

J'aimerais voir avec vous comment normaliser mes données.

J'ai réalisé des tests d'absorbance dans une expérience. J'ai eu beaucoup d'échantillon à analyser (par plaque).

Chaque plaque possède sa propre gamme et possède un échantillon commun à tous.

La variabilité biologique fait que le même échantillon sur 8 plaques différentes varie ainsi :

Plaque 1 : 0,500391373
Plaque 2 : 0,305503285
Plaque 3 : 0,282380655
Plaque 4 : 0,25021627
Plaque 5 : 0,522922055
Plaque 6 : 0,471197523
Plaque 7 : 0,508111723
Plaque 8 : 0,462569409

Donc moyenne = 0,412911537


Comment faire pour normaliser mes autres échantillons par rapport à la moyenne (ou autre) de cet échantillon ?

Cela permettrait "d'uniformiser" les données entre mes plaques.

Je vous remercie !
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[Flyingbike]

Vous avez donc un calibrateur
Dans la théorie, il faut prendre une référence (valeur du calibrateur dans une des plaques, ou la moyenne), et multiplier l'ensemble des valeurs de chaque plaque par le coefficient donné par le rapport entre votre référence et la valeur du calibrateur dans la plaque correspondante. Ainsi, tous les calibrateurs se retrouveront avec la même valeur sur chacune des plaques, et les autres valeurs seront modifiées de la même façon.

Après, dans les faits, une telle variabilité en absorbance pour un même échantillon, je me pose de grosses grosses questions..... a moins que ce soit un truc genre ELISA et qu'il ne se soit pas développé pareil dans chacune des plaques ?

NB : dans ce genre de cas, on peut aussi normaliser entre les plaques en utilisant la gamme !

[jujutou]

Bonjour
Merci pour votre réponse.
Le coefficient dont vous parlez est la différence entre la moyenne de mes calibrateurs et la valeur du calibrateur d'une plaque ?
Le coefficient est donc différent pour chaque plaque, c'est bien ça ?

Il n'y avait une une formule pour ce genre de chose du genre ? du type X = (Y-calibrateur) / calibrateur.
Un truc du genre mais je ne mélange peut être avec quelque chose d'autres...

En effet, c'est un système de cellules transfectés qui réagissent selon la quantité de facteur présent dans une échantillon biologique. L'expérience induit pas mal de variabilité biologique car beaucoup d'étape technique et biologique avant d'avoir le signal final (absorbance).
Donc type Elisa mais plus complexe.

La normalisation par gamme utilise le même principe qu'en haut ? Faire une moyenne de gamme et normalisé par rapport au coefficient de différence ?

Merci de votre aide !

[Flyingbike]

en fait, l'idée c'est que votre gamme serve de calibrateur. Mais pour voir si c'est faisable, il faudrait en savoir un peu plus sur le design expérimental.

[A voir en vidéo sur Futura]

[jujutou]

L'expérience utilise des cellules Hekblue de Invivogen. Ce sont des cellules transfectés pour exprimer un recepteur PRR et qui exprime une phosphatase SEAP lorsqu'il y a activation de ce recepteur. La phosphatase permet ensuite la coloration d'un milieu dans lequels sont les cellules qui passe du rouge au bleu +/- intense selon la quantitée de SEAP exprimé dependant de l'activation du recepteur.

Ma gamme est composé de l'agoniste du recepteur, à des doses croissantes, permettant d'avoir un équivalent zéro et le plateau d'activation. (8 doses croissantes)

J'ai testé mes échantillons en duplicate sur des plaques 96 puits. Donc cela fait 40 échantillons/plaques.

Tous les échantillons sont différents, seul un est identique à toutes les plaques pour justement m'en servire de référence et pouvoir comparer mes plaques les unes aux autres. Le volume d'échantillon déposé est le même pour tous.

Les gammes sont issus de la même préparation pour les différentes plaques et tout à été fait le même jours, sur des cellules au même passage, à la même concentration, même temps d'incubation, et la lecture d'absorbance se fait au même moment.

J'espère que j'oublie rien ?


Comment faire concretement pour utiliser la gamme comme calibrateur ?

Merci de votre aide !

[Flyingbike]

Hello

Je saisis mieux le type d'assay du coup.
Le problème est que comme ce n'est pas linéaire, normaliser sur un seul point peut vous faire dévier inutilement de la réalité.
Dans ce cas, ce qu'il est plus prudent de faire, c'est de calculer pour chaque plaque indépendamment le niveau d'activation pour chaque échantillon (y compris calibrateur) avec la gamme correspondante selon les modalités habituelles (soustraction du blanc, régression polynomiale (je suppose), et calcul des inconnues à partir des absorbances, etc.) comme si les manips étaient indépendantes.

Et ENSUITE, normaliser ces résultats secondaires, en calculant une moyenne pour tous les calibreurs, et en ajustant, plaque par plaque, les résultats selon le ratio calibrateur plaque/moyenne calibrateurs.
Ainsi, une fois fait, vous aurez pour le calibrateur la même valeur dans chacune des plaques. Et les résultats des échantillons seront réajustés.


Vous voyez ?