M1 Biologie moléculaire et expression du génome eucaryote - Antizyme1 Az1

[Kyushiu]

Bonjour !

Je suis face à un sujet type examen d'expression du génome eucaryote et j'ai du mal sur quelques questions. Je me demandais si vous pourriez m'aider!

______________________________ ______________________________ ________________________

Partie A : (extrait d’un examen, 1 h). L'antizyme-1 (Az1) est une protéine impliquée dans la régulation du métabolisme des polyamines. Az1 est un inhibiteur de l'ornithine décarboxylase. Récemment, il a été montré l'existence de deux formes de la protéine Az1. Les deux protéines diffèrent par leur taille, une forme longue (29 kDa, 227 acides aminés) et une forme courte (24,5 kDa, 194 acides aminés).

L'analyse de la séquence de l'ARNm dans la partie 5' terminale montre l'existence de deux codons AUG (notés AUG1 et AUG2).

Des cellules en culture sont transfectées avec différents plasmides (pistes 1 à 4) contenant la séquence sauvage ou mutée du cDNA de l'Az1. Après transfection, les lysats cellulaires sont analysés par la technique de Western avec des anticorps anti-Az1.
L'image obtenue est la suivante :

a.PNG

Piste 1 : cDNA sauvage
Piste 2 : cDNA muté (ATG2 -> GCG)
Piste 3 : cDNA muté (ATG1 -> GCG)
Piste 4 : cDNA muté (GCGGCCGGATG1GTG -> GCGGCACCATG1GTG)

Commentez la figure. Que peut-on conclure de cette expérience ?
Expliquer les résultats de la piste 4?
______________________________ ______________________________ ________________________

Pour moi :

Piste 1 : C'est notre témoins positif, également marqueur moléculaire pour nos deux protéines
Piste 2 : En changeant ATG2 on ne forme plus de protéine a 24.5 kDa, mais celle de 29 kDa et trois autres de petite taille (peut être sans importance ?)
Piste 3 : en changeant ATG1, on ne forme plus que la protéine à 24.5 kDa, de manière plus intense car notre complexe traductionnelle n'est plus en mesure de reconnaitre ATG1 ce qui réduit la compétition dans la transcription.
Piste 4 : L’intensité de nos deux bandes ne sont plus les mêmes. Celle de 29 kDa est désormais plus intense que sur notre témoins et celle de 24.5 kDa moins intense. Modifier la séquence en amont de notre AUG va favoriser la production de la protéine de 29 kDa. On est donc face a contexte favorisant la transcription, ou une séquence régulatrice silencé par les modifications.

Globalement, modifié l'ATG empêchera la production de la protéine correspondante.
______________________________ ______________________________ ________________________

Dans une seconde expérience, les cellules transfectées avec le cDNA sauvage sont fractionnées. Les différentes fractions cellulaires sont analysées par Western comme précédemment.

b.PNG

Comment peut-on expliquer ces observations ?
Ces expériences permettent-elles de dire si l'initiation de la traduction est "coiffe-dépendante" ou "IRES-dépendante" ? Comment le montrer expérimentalement ?
______________________________ ______________________________ ________________________

C'est surtout ici que j'ai du mal.

Piste T : fait office de témoin.
Piste M : La protéine à 29 kDa est sûrement mitochondrial.
Piste C : La protéine à 24,5 kDa est sûrement membranaire ou soluble et dans le cytosol.

Mais je n'arrive pas a aller plus loin dans l'analyse, pourriez vous m'aiguiller ?

Merci d'avance !
Kyushiu
-----

[blisax]

Bon et bien je me lance !

Partie A:

Déjà la présence de deux codons start au sein du même ARNm nous indique que c'est un ARNm polycistronique, ce qui n'est pas la norme chez les eucaryotes.
Je suis d'accord, la piste 1 est le contrôle.
Sur la piste 2 ça se corse, on mute un site d'initiation donc on attend qu'une seule bande correspondant à la protéine associée au premier codon start. Néanmoins dans la portion de l'ARNm associé au second codon start on peut trouver des codon AUG qui devaient coder pour une méthionine. Néanmoins si le codon start est muté, ces codons seront interprétés comme des nouveau codons starts produisant une version tronquée de la forme courte qui est dégradée formant ces multiples bandes.
Sur la piste 3 c'est simple, le site d'initiation de la forme longue est muté ce qui fait disparaître sa bande.
Je suis assez d'accord avec ton interprétation de la piste 4. En fait j'imagine que l'idée est de muter une séquence IRES (ce qui devrait répondre à la question de la partie B).

Partie B:

Je suis d'accord avec tes interprétations mais je dois dire que je ne comprends pas pourquoi la bande 24kDa de la piste C est plus grosse que celle de la piste T...

Bon courage !