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Hplc



  1. #1
    tataly

    Hplc


    ------

    Bonjour,

    Je travaille sur une chaine HPLC et au passage du méthanol (pour laver notre colonne après avoir passer nos échantillons), la pression monte très haut (on la stoppe à 200 bars). Même si on fait un lavage à l'eau avant on observe le même phénomène.

    Avez vous des explications à ce problème?

    Merci d'avance pour vos réponses.

    -----

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  3. #2
    Le chimiste fou

    Re : Hplc

    Alors il y a plusieurs phénomène à ça:
    - Ton liquide est trop visqueux pour passer dans la colonne ce qui la bouche.
    - ta colonne est boucher par un sel quelconque non soluble à l'eau.

  4. #3
    tataly

    Re : Hplc

    le liquide que j'utilise n'est pas visqueux
    ma phase mobile est composé de tampon phosphate monobasic et dibasic.
    Même sans faire passer mes solutions dans la colonne, elle ne supporte pas le méthanol. C'est une colonne C18

  5. #4
    Le chimiste fou

    Re : Hplc

    Bah pourtant...
    Ta phase mobile est acétonitrile/tampon phosphate pH4 je suppose (c'est ce que j'utilise en générale).
    Avec une C18, le méthanol n'est pas du tout retenue (ou vraiment infiniment peu). Là c'est une question qui trouble...

  6. #5
    tail

    Re : Hplc

    Bonsoir
    Je pense que tu lave d'abord ta colonne à l'eau pour éliminer les phosphates qui precipitent avec une forte concentration de methanol et boucheraient la colonne.
    Apres lavage des phosphates la colonne sous eau tu remplace par du methanol ou mieux tu monte en gradient avec du methanol. Dans ce cas tu as un melange eau methanol et la viscosité de ce melage est importante maximum vers 50/50 ce qui fait fortement monter la pression en tête de colonne (200 bars à 1.5 ml/min avec 25 cm dia:4.6 et 5µm comme phase n'est pas serprenant).

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    tataly

    Re : Hplc

    Effectivement nous aussi on a du mal à comprendre...

    Au début on lavait directement en méthanol sans passer par l'eau. Comme c'est montée en pression on a essayé de faire mélange eau méthanol 50-50 puis 100% méthanol mais ça ne veut rien entendre dès que l'on passe à 100% ça grimpe en pression.

    Se peut il que mon produit est précipité avec le méthanol (alors qu'il est super soluble dans l'eau) et qu'il n'arrive plus à se resolubiliser, il se retrouve donc accrocher à la colonne. Si cela est possible, comment puis je faire pour le décrocher?

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  10. #7
    tataly

    Re : Hplc

    le problème le plus grave c'est que si on n'arrête pas la pression elle continue de grimper plus de 300 bars et là on a risque de casser la cellule de détection

  11. #8
    tail

    Re : Hplc

    bonsoir
    pas de risque pour la cellule de detection dont la sortie est à l'air.
    La pression est mesurée entête de colonne et c'est dans la colonne que se fait la perte de charge.
    Pour un lavage en cas de doute on peut toujours séparer la colonne du detecteur.
    Le risque pour la cuve de detection est un bouchage en sortie de cuve.

  12. #9
    tataly

    Re : Hplc

    bah justement la cellule de détection a fini par se casser : vu que le lavage a lieu automatiquement en fin de manip et comme ça fonctionne bien pendant la manip je ne suis pas restée a côté pendant 9 heures. Dès le signal sonor je suis arrivée et elle a cassé la pression était à 400 bars!!

    En ce moment je fais des lavages (colonne déconnecté de la cellule de détection), dans l'eau ps de problème dès que j'ajoute du méthanol ça grimpe et j'arrête automatique dès que ça atteint 200 bars.

    Donc du coup je ne sais pas trop ce que je peux faire pour éviter cette pression.

  13. #10
    tataly

    Re : Hplc

    merci pour tes réponses.
    bonne soirée

  14. #11
    tail

    Re : Hplc

    Bonsoir
    La c'est grave, il faut trouver la raison
    Tu dis
    Effectivement nous aussi on a du mal à comprendre...

    Au début on lavait directement en méthanol sans passer par l'eau. Comme c'est montée en pression on a essayé de faire mélange eau méthanol 50-50 puis 100% méthanol mais ça ne veut rien entendre dès que l'on passe à 100% ça grimpe en pression.

    Se peut il que mon produit est précipité avec le méthanol (alors qu'il est super soluble dans l'eau) et qu'il n'arrive plus à se resolubiliser, il se retrouve donc accrocher à la colonne. Si cela est possible, comment puis je faire pour le décrocher?


    A quel debit travailles-tu? quel diametre de colonne quel granulometrie?...

    Si je comprend bien vous avez envoyé du methanol pur dans une colonne sous phosphate, ce qui entraine une precipitation des phosphates.
    La on cristallise et il peut y avoir de la casse surtout si l'on ne reagit pas tres vite.

    As-tu changé la colonne est elle bouchée?
    Les phosphates et le methanol on t'il été melangés dans la pompe.

    On peut essayer d'y voir clair:
    1)Debrancher la colonne pomper de l'eau sur les differentes voies à 1 et 5 ou 3ml/min, verifier physiquement qu'il y a le debit et relever la pression (à priori on devrait avoir la pression du aux tuyaux et à l'injecteur ) 1ml/min 10 à 20 bars 5 ml/min 50 à 100 bars.
    si cela n'est pas correct presser à changer les joints des piston de la pompe et verifier les clapets.

    2)si c'est correcte on verifie que le circuit et la cuve ne sont pas bouchés en envoyant de l'eau gentiment avec une seringue ou avec la pompe en reglant la pression max à 10 bars ou moins et à un faible debit. On controle que l'eau s'ècoule en sortie de cuve

    3) On refait la manipulation sans colonne et sans brancher la cuve de detection
    On pompe la solution de phosphate pendant 1 min pour simuler le systeme en fin d'analyse puis on fait le lavage tel que programmé et on regade ce qui sort de la pompe et la pression.

    4) si tout c'est bien passé( il ne doit surtout pas être sorti une solution opalescente de la pompe, ce qui indiquerait qu'il y a une precipitation de phosphate et donc une erreur dans la concerption de votre sequence)

    5) Le systeme sous eau; monter la colonne coté pompe (on ne branche pas le detecteur) se mettre au debit de lavage 1ml/min? et relever la pression en tête de colonne 100 à 150 bars? constater que l'eau sort de la colonne.
    sinon il devrait y avoir une montée en pression à la pression max ou la pompe a un probleme.

    6) mettre le debit à 0.3 ml/min 100 % pendant 2 minutes relever la pression 50 bars? et monter en gradiant eau methanol jusqu'à 100% en 10 min la pression doit augmenter jusquà 100 150bars autour de 50 % de methanol puis redescendre autour de 50 bars.

    7) si tout est OK il reste à faire une analyse et un lavage sous controle en faisant attention aux debit et aux pressions.


    Excuse moi c'est un peu long, essaye de voir le pourquoi de chaque chose je ne l'ai pas forcement explicité , si ce n'est pas clair demande.

  15. #12
    tataly

    Re : Hplc

    POur répondre à tes question,

    on utilise un débit de 1mL/min sur une colonne C18.
    On est toujours sur la même colonne qu'on essai de nettoyer mais pour l'instant le méthanol nous pose toujours c'est problème de pression.

    Quand on passe de l'eau dans la colonne on est à 58/60 bars à 1mL/min.

    Je vais essayer de faire ce que tu m'as indiqué, je te tiens au courant.

    Merci pour ses conseils

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  17. #13
    tataly

    Re : Hplc

    bonjour,

    on s'est aperçu que le problème vient avant la valve de purge. Le soucis vient peut être de la pompe qui a reçu du méthanol (et rien que çà normalement). Le fait de faire passer de l'eau fait quand même monter la pression vu que le liquide est bouger quelque part et ne sors pas. Que peux t on faire à par démonter la pompe?

    Merci

  18. #14
    tail

    Re : Hplc

    bonjour
    démonter une pompe ne pose généralement pas de difficulté particuliere.
    Il est même conseillé de changer les joints de piston regulierement .
    Par contre ne pas démonter les electrovannes si les systeme est constitué de 4 electrovannes tarées.

    J'ai pensé à une cause ayant pu casser la cellule sans autre erreur.
    Si la sortie de cuve de detection se fait par un capillaire metallique plongeant dans une poubelle (on utilise normalement un tuyau teflon souple).La poubelle contient les solutions de phosphate; lors du lavage au methanol on induit une precipitation en sortie de tuyau dans la poubelle si le tuyau se bouche la pression de tout le systeme augmente et dans ce cas la cuve se retrouve à la pression max de la pompe et explose évidement.

  19. #15
    jgiovan

    Re : Hplc

    Un petit truc me chiffonne :

    Vous ne programmez pas de pression max. dans votre séquence de lavage ?
    Je protège toujours mon HPLC en programmant une pression de 300 ou 350 bar au maximum (ainsi qu'une pression minimum en cas de fuite). Le système s'arrête automatiquement dès la limite atteinte.

  20. #16
    tail

    Re : Hplc

    bonjour
    jgiovan effectivement ceci est une évidence de programmer une pression mini et maxi, c'est vrai qu'il est difficile de tout prèciser lorsque l'on aborde un probleme à distance . Pour avoir toutes les information il faudrait demander le listing complet des methodes; j'admet probablement à tord que les bases sont connues.

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