Méthode de Folin-Ciocalteu

[Sephiroth300]

Bonjour à tous!

Je dois doser la concentration totale en polyphenols de différents vins, j'ai donc choisi la méthode de Folin-Ciocalteu, seulement, d'une analyse à l'autre, mes résultats sont extrêmement différents (parfois du simple au double!). J'aimerais que vous m'aidiez à trouver pourquoi et à m'aider à améliorer la méthode. Voici mon protocole:
Dans un tube à essais:
-mettre 20µL de chaque solution de calibration (0 50 100 150 250 500mg/L), ou 20µL de vin blanc, ou 2µL de vin rouge
-ajouter 1,58mL d'eau
-ajouter 100µL du réactif de Folin-Ciocalteu
-attendre entre 30 secondes et 8 minutes et ajouter 300 µL d'une solution à 20% de Na2CO3
-attendre 2h et mesurer l'absorbance contre le blanc à 750nm

Je vous en supplie aidez-moi

Merci d'avance

Cordialement
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[Sephiroth300]

personne n'a d'idée

[benji17]

Et si tu passes plusieurs fois le même échantillon, ça varie ou pas?

[benji17]

Et les absorbances que tu mesures pout les vins se situent bien aux alentours de 0,3?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Sephiroth300]

oui l'absorbance change à chaque fois, même pour le même échantillon
j'utilise un microplate reader (désolé je sais pas comment ca se dit en français, je suis en stage en Angleterre)
l'absorbance mesurée oscille entre 0,15 et 0,27, peut-être est-ce un peu faible....

[invite665a0d0b]

Bonjour
Le protocole manque un peu de précision, (attendre entre 30 secondes et 8 minutes.... puis attendre 2 heures avant la lecture) tout celà en utilisant des microplaques et un lecteur dont on éspère qu'il a été prévu pour. J'ai le sentiment que ton protocole est plutôt bricolé. Je te propose de jeter un oeil sur le "RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – de l'OIV tome I edition 2010 qui est téléchargeable gratuitement ici http://news.reseau-concept.net/image...0_vol_1_FR.pdf
il faut rechercher la méthode OIV-MA-AS2-10 (Indice de Folin-Ciocalteu) et de consulter les précautions relatives à la mise en oeuvre, faute de quoi, les mesures que tu réalises risquent d'être fantaisistes.
Cordialement
rls

[Sephiroth300]

merci pour vos réponses

rls, la méthode que tu m'as proposé m'a l'air correcte, le problème est que la machine que j'utilise pour mesurer l'absorbance, projette la lumière par le bas et la récupère en haut, ce qui permet 96 mesures simultanées d'absorbance. Or ils demandent de mesurer l'absorbance sur 1cm puis mesurer cette absorbance par 20 ou 100, mais je ne peux pas mettre 1cm (en fait, je ne peux pas régler la longueur à traverser, tout dépend du volume que je place dans la cuvette)
en espérant avoir été clair...

[invite665a0d0b]

Bonjour
La mesure de la coloration est fonction de l'épaisseur traversée par le faisceau lumineux (Loi de Berr-Lambert) si ce paramètre varie en fonction des échantillons, ne cherche pas plus loin l'incohérence de tes mesures se situe ici.
Dans tous les cas cette méthode ne semble pas avoir fait l'objet d'une validation sérieuse les résultats obtenus sont sans intérêt.
Cordialement
rls

[benji17]

Si l'epaisseur de solution traversée par le faisceau varie, normal que tu n'es pas de résultats satisafaisants! (cf loi de Beer Lambert)

Edit: grillé...!

[Sephiroth300]

ouh la merci je connais cette loi
j'ai toujours mis le même volume pour chaque échantillon et dans chaque analyse!!!(150µL)
donc la variation ne peut pas être expliquée par Beer-Lambert....

[Sephiroth300]

je suis en train d'utiliser ta méthode rls, et en utilisant des standards je vais essayer de déterminer la concentration de mes vins en polyphenols
en tout cas merci pour votre aide!

[Sephiroth300]

il y a quelque chose que je ne comprends dans cette methode, c'est qu'ils ne preconisent pas l'utilisation de standards afin de determiner la concentration en polyphenols, elle permet juste de donner un "indice" afin de comparer les vins entre eux

le probleme est que je dois imperativement connaitre la concentration et pas seulement un indice, donc que dois-je faire?si cette methode est vraiment imprecise, que me conseillez-vous (car je dois imperativement determiner la concentration pour mon stage, et ils n'ont apparemment pas envie que je laisse tomber cette methode, sans pour autant me donner des pistes....)

s'il vous plait aidez-moi, toute aide sera la bienvenue, je ne sais pas quoi faire depuis 2 semaines que je suis la dessus....

Merci d'avance
cordialement

[moco]

Je recopie ton commentaire du 20.5 à 12:59, et je le mets en italique, car il est totalement incompréhensible :

rls, la méthode que tu m'as proposé m'a l'air correcte, le problème est que la machine que j'utilise pour mesurer l'absorbance, projette la lumière par le bas et la récupère en haut, ce qui permet 96 mesures simultanées d'absorbance. Or ils demandent de mesurer l'absorbance sur 1cm puis mesurer cette absorbance par 20 ou 100, mais je ne peux pas mettre 1cm (en fait, je ne peux pas régler la longueur à traverser, tout dépend du volume que je place dans la cuvette)

Qu'est-ce que c'est que cette histoire de machine qui projette la lumière par le bas vers le haut ? Le bas de quoi ?
1. En quoi cela a-t-il de l'importance ? En quoi cela constitue-t-il un problème ?
2. En quoi cela permet 96 mesures d'absorbances ? D'où vient ce chiffre de 96 ? Pourquoi 96 ? Pourquoi pas 1 ?
3. Que veut dire "Or ils demandent de mesurer l'absorbance sur 1 cm" ? Si "ils" le demandent, est-ce à dire que tu le fais, ou que tu ne fais pas ? Si non, pourquoi ne le fais-tu pas ?
4. Que veut dire "mesurer cette absorbance par 20 ou 100" ? 20 ou 100 quoi ? Fais-tu 20 ou 100 mesures susccessives ?
5. Que veux-tu dire par "je ne peux pas régler la longueur" ? pourquoi faudrait-il régler la longueur ? Que veut dire "tout dépend du volume que je mets dans la cuvette" ? Est-ce que tu ne connais pas ce volume ? Pourquoi ?
On n'y comprend rien. Donc on ne peut pas t'aider.

[Sephiroth300]

bon si je n'ai pas été très clair je m'en excuse, je vais essayer de préciser un petit peu mon protocole
la machine que j'utilise permet de lire simultanément 96 absorbances (car la plaquette contient 8*12 interstices)
je vous envoie le lien de wikipedia sur la machine
http://en.wikipedia.org/wiki/Plate_reader
la plaquette entre dans la machine, où sont placées 8 lampes qui projettent la lumière à travers les échantillons, du bas vers le haut
je dois mettre les échantillons dans les interstices de la plaquette, je place dons 150µL (volume arbitraire, prélevé à la pipette de précision), mais ce volume ne représente pas 1 cm de trajet lumineux, c'est-à-dire que dans le protocole proposé par rls, on me demande de mesurer l'absorbance sur 1cm et de multiplier cette absorbance par 20 ou 100 en fonction du vin. Seulement je n'ai aucun moyen de déterminer la longueur traversée par le faisceau, car cette longueur dépend du volume!
petite image pour illustrer la machine


je n'ai jamais utilisé cette machine avant, je ne dispose pas du mode d'emploi et personne dans l'entreprise ne peut m'aider et pourtant on me demande de l'utiliser quand même, c'est peut-être pour ca que je galère un peu

Pour ce qui est de mesurer l'absorbance par 20 ou 100, je me suis trompé, je voulais dire multiplier, je m'en excuse

[invite665a0d0b]

Bonjour
Le réactif de Folin-Ciocalteu ne permet qu'une appréciation globale des agents réduisant le réactif phosphotungstique-phosphomolybdique. La méthode est non spécifique et sur un mélange complexe comme le vin il est inutile d'espérer doser des spécifiquement des polyphénols, on ne peut qu'obtenir un indice reflétant plus ou moins la quantité d'agents réducteurs en solution et entre autres des polyphénols présents. Si tu veux un dosage spécifique, il te faut une méthode spécifique, par exemple une méthode chromatographique. Une recherche avec les mots clés "polyphénol " "dosage" "vin" devrait aider.
Cordialement
rls