Problème temps de rétention avec HPLC

[invite8b6cf929]

Bonjour,

J'aurais plusieurs questions à vous poser.

Tout d'abord, je suis en dernière année de master en science industrielle option biochimie. Pour terminer, mes années d'étude, j'effectue un stage qui consiste à l'élaboration d'une technique d'analyse de détection du difénacoum, de la bromadiolone et du brodifacoum qui sont 3 matières actives utilisées dans les rodenticides sur HPLC.

Il me semblent que j'ai trouver la bonne technique c'est-à-dire phase mobile méthanol, colonne C18, débit 0,800ml/min, longueur d'onde 315 nm. Mais, le temps de rétention n'est pas toujours le même pourtant c'est-à-dire qu'il varie de 2,75 à 2,89. Est-ce normal? Que dois-je faire pour qu'il sorte tout le temps au même temps?


Merci d'avance pour vos réponses
-----

[moco]

C'est difficile de te répondre de manière assurée. Mais est-ce qu'il n'y aurait pas de ta part un manque de reproductibilité au moment de l'injection ? Est-ce que la température est toujours rigoureusement la même ? Est-ce que 2.75 et 2.89 sont réellement différents ? Tu n'es pas sans avoir que, quoi qu'on fasse, il y a toujours une certaine incertitude ou une certaine dispersion dans l'appréciation des résultats d'une mesure, HPLC ou non.

[invite8b6cf929]

Merci de votre réponse rapide.

Concernant une erreur de ma part cela m'est impossible vu que l'injection se fait par un injecteur automatique. La température est stabilisée par un four à 40°C. Il n'y a pas de différence entre les deux pics à part le temps de rétention. Cela ne peut-il pas être du à la phase mobile?

[CN_is_Chuck_Norris]

oui si ta phase mobile est constituée d'un mélange de solvants et que c'est toi qui fait ce mélange.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8b6cf929]

Ma phase mobile est du méthanol 100% et il n'y a même pas eu de transfère dans un autre conditionnement! Ne faut-il pas que je fasse une régénération de la colonne? Comment procéder si oui? Le dernier a avoir utiliser à laisser l'appareil en mode gradient 80% Acétonitrile et 20% méthanol, Cela peut-il avoir des conséquences? J'ai fait une purge et plusieurs essais à blanc de méthanol!

[CN_is_Chuck_Norris]

Si tu as fait plusieurs blanc, il y a peu de chances que ça vienne d'un prédécesseur.
As-tu fait l'injection plus de 2 fois. le temps de rétention tourne-t-il autour d'une valeur moyenne?
Cela dit, la variation est minime entre 2,75 et 2,89.

ps: quel est le temps de ton run?

[invite8b6cf929]

J'ai fait 18 test qui tourne tous autour de 2,70 à 2,90 mais lorsque j'ai dilué ma matière active avec de l'hexane et dichlorométhane (4 répétitions), j'ai un temps de rétention vers 2,5 min est-ce normal?? et je n'ai pas de pic pour l'hexane et le dichlorométhane qui sont en forte concentration! est-ce normal pour une longueur d'onde de 315 nm?

Mon temps de run est de 6min.

[CN_is_Chuck_Norris]

c'est ton dichlo/hexane qui entraine le produit.
l'absence de pic pour dichlo et hexane est normale.

[invite8b6cf929]

Pourquoi l'absence de l'hexane et du dichloro est elle normal?

[CN_is_Chuck_Norris]

si tu fais le spectre d'absorbance des ces composés, tu verras qu'il n'y a pas de bande d'absorption à cette longueur d'onde.
Pour qu'il y ait absorption, il faut un chromophore.

[invite8b6cf929]

Merci pour vos réponses.

J'aurais une autre question, est-ce normal que le temps de rétention diminue lorsque l'on diminue la concentration? (le temps passe de 2,87 à 2,37 pour concentration de 50ppm à 0,005 ppm) Ne doit-il pas rester constant?

[CN_is_Chuck_Norris]

Si, il devrait.
cela étant, si ta solution stock est encore plus diluée avec ton mélange CH₂Cl₂/hexane, le produit sortira encore plus vite.

[invite8b6cf929]

Le souci est que la solution stock a été dilué au méthanol. Donc, cela n'est pas normal?

[CN_is_Chuck_Norris]

il y a donc un problème.
une solution 1 de concentration C1 dans MeOH et une solution 2 de concentration C2 dans le même solvant doivent donner un résultat indique.
seule la réponse en absorbance est plus faible.

[invite8b6cf929]

Quelle est peut être la cause de ce problème?

[CN_is_Chuck_Norris]

je n'ai pas d'éléments de réponse pour le moment. dsl.