enzymologie Km et Vmax

[inviteb72bd088]

bonsoir !

je fais appel à vous car je galère vraiment dans mes cours alors si quelqu'un peut m'aider pour ce qui va suivre ...


l'activité de la trypsine a été suivie par hydrolyse du substrat Benzoyl-DL-arginine-para-nitroanilide.La para-nitroanilide libérée par hydrolyse absorbe à 410nm et est suivie par spectro. On nous montre une figure représentant les cinétiques d'apparition du produit en fonction du temps dans les 2 premières minutes de la réaction, ces mesures ont été effectuées à 5 concentrations initiales en substrat.

Donc sur le graphe, il y a 5 droites :

Pour Substrat = 800µm y = 0,0084x+0,2705
Pour Substrat = 600µm y = 0,007x+0,092
Pour Substrat = 400µm y = 0,0054x+0,0794
Pour Substrat = 200µm y =0,0035x+0,0309
Pour Substrat = 100µm y = 0,0019x + 0,0148

Je dois, en utilisant la représentation de Lineweaver et Burk déterminer graphiquement d'après ces cinétiques le Km et le Vm de la trypsine

cette représentation est sous la forme 1/vi = f(1/S)

Comment déterminer Vi ? c'est la pente de la cinétique . Par exemple, pour S = 800µm on a vi = 0,0084µmol.l^-1 ; pour S = 600µm on a vi = 0,007µmol.l^-1

je peux alors déterminer 1/vi pour les différentes concentrations en substrat



J'ai le corrigé, je suis censée trouver sur mon graphe Vmax = 0,025 DA.sec^-1 (on déduit le Vmax grâce au 1/vmax )
et km = 716µm ( on le déduit grace à -1/km )


merci
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[inviteb72bd088]

( donc bien sur ma façon de faire est totalement fausse 'j'imagine , si je trace les points obtenus ( ex : point A ( 1/800 ;1/0,0084 ou point B ( 1/600 ; 1/0,007 ) j'obtiens pas la bonne représentation de burk ...

[moco]

Si tu veux qu'on t'aide, il faudrait au moins nous donner les moyens de comprendre. Tu parles de graphiques et de droites. Mais tu ne dis pas ce que signifient les variables x et y. C'est pareil pour la suite. Qu'est-ce que tu appelles Km, Vm, S, Vi, DA, Vmax ?

[inviteb72bd088]

désolé pour mon manque de précision
Km : constante de michaelis
Vm : vitesse maximale = Vmax
S : substrat
Vi = vitesse initiale
A : degré absorbance



merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[moco]

Et que signifie x et y ? Surtout y ?

[inviteb72bd088]

ces équations où on voit x et y sont notées à côté u graphique que je viens d'envoyer , je n'ai pas d'autre précision ...

mais je sais pas si je dois m'en servir .. ?

Dans un 1er temps, le but est de de trouver Vmax et Km en faisant la représentation de Burk ( (1/vi = f(1/s ) ) ( que je dois réussir à faire à partir du graphe qu'on me donne ... )

[moco]

Il ne faut pas te rendre plus ignorante que tu ne l'es. On ne confie pas une tâche de cinétique pareille à un enfant de maternelle, Tu devrais au moins deviner que x désigne le temps. mais en quelle unité ? Seconde ou minute ? Et tu devrais savoir que y désigne quelque chose qui est soit la concentration, soit l'absorbance, soit autre chose, que je ne peux pas deviner, mais que toi, tu devrais savoir et le dire. Sinon, c'est inutile d'aller plus loin.
D'autre part, ton image attachée est illisible.
Enfin, tu dis que S est le substrat. Mais j'en doute. Je serais plutôt prêt à croire qu'il s'agit de la concentration du substrat. La seule chose qui me retient de l'affirmer est que ce S se mesure en µm, qui est l'abréviation de micromètre, donc d'une longueur.
Mais apparemment tu t'acharnes à ne pas être claire dans tes explications. Tu ne m'as toujours pas dit ce que signifie DA.
Je vais finir par me fatiguer à essayer de te convaincre qu'il faut que tu expliques clairement de quoi il s'agit, et je vais abandonner ...

[inviteb72bd088]

oui, en effet c'est bien

S= 800µM , S = 600µM , S = 400µM , S=200µM , S =100µM ( µM = µmol.l^-1 ) et non µm micromètre comme je l'avais précédemment écrit... pardon pour ce manque de rigueur, ça n'avait pas de sens ..


Ce sont donc les différentes concentrations du substrat, oui.

DA : degré d 'absorbance


oui , sur ce graphe x représente un temps en seconde et y l'absorbance de la trypsine

donc à partir de ces données, je dois trouver la constante de Michaelis Km et la vitesse maximale .


On me donne sur le schéma que j'ai joint les équations de droites y = ax+b avec a coeff directeur, représentant la pente de la droite, donc la vitesse initiale ... ?

Je viens de retracer un graphe Vi = f (S) avec vi: vitesse initiale et S concentration en substrat ( ce graphe n'est donc pas la représentation de burk car je n'ai pas pris l'inverse ... mais un collegue me dit de faire comme cela . )

je trace ma droite :
exemple de points
A ( 100µM ;0,0019) , B ( 200µM ; 0,0035 ) , C( 400µM ;0,0054 ) , D ( 800µM;0,0084)

le point d'intersection entre l'axe es ordonnées et ma droite tracée c'est Vmaximale
Le point 'intersection entre l'axe des abscisses et ma droite tracée c'est -km

donc ça me ferait : Vmax = 0,0025dA.sec^-1 et non Vmax = 0,025dA.sec^-1 comme je l'ai noté dans mon TD
Pour Km, je ne trouve pas du tout 716µM comme je l'ai noté dans mon TD mais une valeur beaucoup plus faible 343µM