TIPE: chromatographie sur colonne

[invitedcc602e9]

Bonjour,
Nous avons deux questions que nous nous posons pour notre Tipe. Pouvez-vous nous aider?
Pour notre TIPE, nous avons choisi de travailler sur la chromatographie. Nous avons commencé par étudier la chromatographie sur colonne et nous voulons chercher à mesurer l'efficacité d'une colonne, comme on pourrait le faire sur un chromatographie liquide ou gazeuse. Nous avons penser à faire un dosage à chaque litre de solution qui sort de la colonne... Connaissez-vous une autre méthode pour mesurer l'efficacité?

Nous pensions faire aussi sur la chromatographie d'exclusion mais ne savons quoi faire... Pouvez nous nous juste quelques pistes pour démarrer...

Merci
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[inviteeb6310ba]

Pourquoi ne pas mesurer la séparation d'un mélange de différents colorants sous l'action d'un éluant? En prenant des photos par intervalle réguliers (ou juste en mesurant l'écart entre les colorants) cela permettra de comparer l'efficacité de différentes colonnes!

[inviteff6062b6]

En HPLC, l'efficacité d'une colonne peut être déterminée par le nombre de plateaux théoriques N. On peut sans doute transférer ce calcul à ce qui vous intéresse ici. La formule de calcul est N=16(tR/ω)² avec tR le temps de rétention de ton produit et w la largeur du pic (en HPLC toujours).
Ici, vous devez connaitre (ou avoir calculé) le débit de votre colonne. En effectuant des dosages dans les tubes que vous récupérez, vous allez avoir le nombre de tubes (donc le volume) dans lesquels vous retrouvez votre produit, mais également le volume nécessaire pour éluer votre produit. Par exemple, vous remplissez 5 tubes de 5ml en sortie de colonne avec un débit de 2ml/min et votre produit apparait dans les 6e et 7e tubes. Il y a donc 2 tubes de produit soit 10ml, c'est-à-dire 5min. C'est la largeur w de votre pic. Pour calculer le temps de rétention, même principe, 6x5/2=15min. (le produit sort entre la fin du 5e tube et la fin du 7e tube, donc 6 pour la moyenne).
Vous pouvez calculer N. Plus N est grand, plus la colonne est efficace.

Vous pouvez également travailler sur le temps qui sépare la sortie de 2 produits différents. Ce sera alors un calcul de résolution de colonne.

[invitedcc602e9]

@Sephiroth300: Nous avons effectivement choisi un colorant vert que nous séparons avec une colonne de gel de sillice car la colonne d'alumine était très lente et ne fonctionnait pas... est-il interressant de faire varier l'éluant choisi ou faut-il changer uniquement la silice pour mesurer l'efficacité d'une colonne?

@Bastinho: merci beaucoup! nous allons tester votre méthode... Nous avions penser aussi à analyser par spectrophotométrie les solutions récupérées et ainsi avoir la concentration de chaque tube (nous travaillons avec un colorant vert, qui se sépare donc en bleu et en jaune)! (Un seul problème il faut diluer la solution...)

[A voir en vidéo sur Futura]

[Kemiste]

@Sephiroth300: Nous avons effectivement choisi un colorant vert que nous séparons avec une colonne de gel de sillice car la colonne d'alumine était très lente et ne fonctionnait pas... est-il interressant de faire varier l'éluant choisi ou faut-il changer uniquement la silice pour mesurer l'efficacité d'une colonne?

Quel système d'éluant utilisez-vous? Si vous êtes en isocratique (= même éluant durant toute la séparation) et que la colonne dure trop longtemps, vous pouvez passez à un gradient (= faire varier la composition de l'éluant durant la séparation) ou encore faire éluer le colorant bleu (ou jaune je ne sais pas lequel est élué en premier) puis changer de système pour éluer le 2ème colorant.
Quelle quantité de silice utilisez-vous pour quelle quantité de colorant?

Enfin, je ne pense pas que vous y aillez accès, mais il existe des système couplés avec un détecteur UV, ce qui permet d'avoir directement les "pics" UV.

[invitedcc602e9]

Bonjour,
nous utilisons de l'ethanol pour l'éluant durant toute la séparation...
Nous n'avons jamais pris en compte la quantité de sillice est-ce vraiment important?
Nous mettons a chaque fois une goutte ou deux de colorant car si nous en mettons plus, cela ne fonctionne très peu et ne donne pas une très belle séparation...

[Kemiste]

Bonjour,
Oui la quantité de silice est important. S'il n'y a pas assez de silice, la séparation va être mauvaise mais s'il y a trop de silice le temps d'élution va être (inutilement) plus important, surtout si un produit traine sur la colonne.
Petite question, comment faites-vous votre colonne? Sous pression ou non?

[invitedcc602e9]

Nous ne faisons pas notre colonne sous pression... La manip' est donc assez longue...

Nous voulons analyser ce que nous récuperons par spectrophotométrie car nous n'avons pas trouvé de protocole pour faire un dosage ce que nous récupérons... Connaissez-vous un protocole ou pouvez-vous nous donner des pistes?

Nous n'avons pas de detecteur UV mais existe-t-il un autre moyen?

Merci

[Kemiste]

Chercher vous à faire du qualitatif ou du quantitatif? En mesurant l'absorbance de la solution obtenue à chaque tube collecté, vous pourriez tracer une courbe donnant l'absorbance en fonction du temps et ainsi avoir les "pics UV" et donc voir si les composés sont bien séparés, si l'élution est rapide... Par contre si vous voulez connaitre précisément la concentration des composés en solution, il faut tout d'abord faire une courbe d’étalonnage et pour ça il faut connaitre la nature exacte des composés utilisés. Mais je pense pas que ce soit vraiment nécessaire.

Quand tu dis que la manip est assez longue, elle dure combien de temps? Dans ton premier message tu dis que tu voulais doser chaque litre de solution obtenue, ce qui me parait énorme pour juste une goutte de colorant... Comment avez-vous choisit votre éluant?

[invitedcc602e9]

Merci pour votre réponse rapide

Nous avons fait une courbe d'étalonnage (une échelle de teinte), car nous voulons connaître effectivement la concentration tous les 3 millilitres (le 1 litre est une erreur...) et ainsi étudier l'efficacité de la colonne. Nous cherchons donc à faire du quantitatif.

Elle dure environ une demi-heure. Ce qui est long pour une séance de seulement deux heures...

Nous avons choisi l'éluant tout d'abord grâce à un protocole d'une prof qui proposait d'utiliser l'éthanol, mais le colorant n'était pas le même que le notre. En approfondissant nos recherches sur internet, nous avons trouvé qu'il fallait utiliser plutôt de l'eau salée pour éluer le jaune et ensuite de l'éthanol pour récupérer le bleu. Nous envisageons d'étudier les molécules des colorants pour comprendre pourquoi.

[Kemiste]

Il y a donc bien un changement d'éluant

Par contre quand tu dis que tu as fais une "échelle de teinte" qu'est ce que tu veux dire exactement? Si tu veux faire du quantitatif, il faut faire des solutions de chacun des constituants du colorant à différentes concentrations pour faire la courbe d’étalonnage. Comment allez-vous exploiter vos mesures de concentration?

PS : 30 min pour une colonne ouverte ce n'est pas si "long" que ça...

[invitedcc602e9]

On veut faire une courbe d'étalonnage avec des concentrations connues en colorant... On mesure l'absorbance de ce que l'on récupère en sortie de colonne et on aura ainsi la concentration. Que voulez vous dire par "exploiter vos mesures de concentration"?

[Kemiste]

Je voulais savoir, comment aller vous représenter vos résultats de concentration, graphe?
Quand tu dis, "courbe d'étalonnage avec des concentration connues en colorant" tu parles tu colorant vert? Ce qu'il faut faire c'est des courbes d'étalonnage avec le colorant jaune et avec le colorant jaune.

[Kemiste]

EDIT : je voulais bien sur dire avec le colorant jaune et avec le colorant bleu

[invitedcc602e9]

Bonjour,

Désolé pour notre réponse tardive...
Après réflexion, nous avions pensé que le quantitatif n'étais pas forcement nécessaire puisque l'absorbance est proportionnelle à la concentration. Qu'en pensez-vous?

Une deuxième question: avec l'eau salée, le jaune part en premier et ensuite le bleu part grâce à une solution d'éthanol... mais les éluants doivent être introduits par ordre de polarité croissante...or l'eau salée est moins polaire est plus polaire que l'éthanol... nous ne comprenons pas pourquoi? avez-vous une explication?

Une dernière petite chose: nous voulons mesurer l'efficacité d'une colonne: est-il intéressant d'étudier différents paramètres comme la hauteur de silice introduite, ou le type d'éluant introduit?

Merci beaucoup

[Kemiste]

Bonsoir,

En effet, pour voir si les composés sont bien séparés le quantitatif n'est pas forcement nécessaire (comme je l'avais dit dans un précédent message).

Pour l'élution il semblerait que ce soit une question de solubilité. Tu peux faire une recherche sur google c'est une manip assez "classique". Par contre es-tu sur que c'est le jaune qui est élué en premier?

Pour la dernière question, l'efficacité de la colonne dépend bien évidement du solvant utilisé, de la hauteur de la colonne ou encore de la pression/du débit...