de la teneur en histamine dans les poissons selon la méthode fluorimètrique de Lerke et Bell

[Neo47]

Bonjour tlm,
Avant de poser ma question je vous présente un résumé de la méthode :
a) Principe :
Extraction de l’histamine par une solution d’acide trichloracétique et séparation par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions et élution par l’acide chlorhydrique. Dosage par fluorimétrie après complexation parl’Ortho_phtaladéhyde(OPA).
b) Mode opératoire :

Extraction de l’histamine :
• On hache soigneusement l’échantillon représentatif de poisson (5g) + 45ml de TCA (10%) + homogénéisation par un mixeur rapide + filtration.
• On prend 0,2 ml de cet extrait on lui ajoute 20 ml de la solution tampon (pH=4,62).

Purification (isolement de l’histamine) :
• La solution est ensuite chromatographie par une colonne remplie de résine échangeuse d’ions selon le mode suivant :
• L’élimination des substances non fixées par l’ajout de 100 ml du tampon. Les amines retenues par la résine, sont élués par l’ajout de 20 ml du HCl (0,2N).

Réaction de complexation et mesure de fluorescence :
• Après l’élution de l’histamine, on récupère 2 ml de l’éluat par une pipette de 2 ml dans un tube à essaie et on lui ajoute successivement :
• 1ml de NaOH + agitation(le milieu doit être basique pour que L’histamine se fixe sur l’OPA à l’étape suivante).
• 0,1 ml de l’OPA (l’OPA ne doit pas dépasser une durée de 3minet 30 seconds dans Le tube).
• 2 ml de l’HCl (0,7N) pour arrêter la réaction
Voila la solution obtenu est mise dans une cuvette pour la mettre dans le fluorimétre et lire la valeur en ppm de poisson, alors là je n'arrive pas à comprendre comment notre fluorimétre nous donne une valeur en ppm (mg/kg de poisson) alors qu'au début de l'analyse on a commencer avec un échantillon de 5g.
Merci !
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[moco]

Où est le problème ? 1 ppm, c'est aussi 1 microgramme par gramme de poisson

[Neo47]

salut moco, le problème c'est que le taux en ppm trouvé (qui est une intensité de fluorescence en faite) est due à la présence d'une quantité d'histamine dans l'échantillon mis dans la cuvette, si on remplace par exemple les 5 grammes au début par 10 grammes j'aurai 2 fois de molécules d'histamine extraite par le TCA est donc à la fin on aura une intensité de fluorescence x2....en d'autre terme si on veut trouver combien de microgrammes ou mg d’histamine existants dans 1kg de poisson, la solution mise dans la cuvette doit correspondre à une masse de 1kg de poisson mais pas de 2ml d’histamine élué à partir de 5 grammes, n'est ce pas ?

[HarleyApril]

Bonsoir

En fait, le fluorimètre te donne la concentration du dérivé fluorescent.
L'étalonnage te permet de trouver la concentration correspondante.
Tu en déduis donc la masse d'histamine que tu as pu extraire de 5g de poisson.
Une règle de trois te donne la teneur en ppm (mg d'histamine par kg de poisson).

Cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]