Bonsoir à tous,
j'ai fait un TP sur l'activité d’une phosphatase alcaline
on a tout d'abord réalisé une gamme étalon avec des concentrations différentes en PNP (produit que l'on obtient après hydrolyse du PNPP par l'enzyme) on note les absorbances et on a une droite d'étalonnage![]()
en suite, on réalise 2 séries de tubes (témoins et l'autre dans lequel on va mettre l'enzyme) avec 1ml de substrat PNPP et du tampon que l'on met au bain marie a 37°c pourquoi mettre à incuber pendant plusieurs minutes? le prof a dit que c'était pour obtenir des conditions optimales mais à quoi ça sert si on a toujours pas mis l'enzyme? pourquoi attendre plusieurs minutes?
ensuite, on incorpore l'enzyme (0.5 ml) et toutes les 5 minutes on prélève 1ML pour les mettre dans des tubes (avec dedans 1ML de soude) pour ensuite mesurer l'absorbance (=lien direct avec la concentration en produit PNP) mais pourquoi prenons nous 1ML? car il faut autant de soude que solution pour être sur de stopper entièrement la réaction?
on demande également la masse d'enzyme présente dans chaque prélèvement? je ne pense pas que ce soit 0.5 ml mais comment on fait pour déterminer ça?
une fois toutes les mesures de DO prises, on peut, grâce a la droite étalon, savoir la concentration en PNP des tubes
on obtient alors une courbe (PNP) en fonction du temps (temps où l'on a fait chaque prélèvement)
on peut alors faire la tangente et obtenir Vi puis on nous demande de calculer l'activité enzymatique et l'activité spécifique là je ne sais pas du tout comment faire...
merci pour votre aide![]()
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