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Mise en culture de cellules souches de neurones



  1. #1
    FinalSpark

    Mise en culture de cellules souches de neurones


    ------

    Hello,

    Ceci n'est pas une question, peut-être hors-charte, mais j'ai pensé que cela pouvait être intéressant de partager: c'est une de mes manips de décongelation directement sur MEA (Multi-Electrodes Array), je réponds avec plaisir aux questions ou commentaires

    https://youtu.be/PUHGzBVdb20
    Nom : thawing.jpg
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    Dernière modification par FinalSpark ; 22/12/2019 à 17h18.
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  4. #2
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Bon, je constate que ma vidéo précédente ne génère pas beaucoup de commentaires un peu pointu, il est vrai.

    Allez, plus visuel. L’évolution d'une neurosphère (cellules souches embryonnaires de cortex de rat) obtenue après 30 jours de culture et mise sur un lit de matrigel (une mixture de protéines générées par des cellules cancéreuses de rat). L’intérêt de cette expérience et de constater la croissance rapide des neurites (indicateur de vie important avant l’exécution du protocole suivant pour la mesure de signaux électriques, qui a eu lieu la semaine dernière).

    Observation par transparence avec une microscopie à contraste de phase. Les ronds blancs sont les trous de la membrane microperforée (10um) sous-jacente. Le diamètre de la neurosphère est de l'ordre de 400 um, donc visible à l’œil nu. J'ai fait la dernière image le 18 décembre.

    https://youtu.be/lqwnyRWLj3w
    Nom : crop_image2.jpg
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  5. #3
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Finalement, après beaucoup d'efforts, nous avons enfin réussi à enregistrer une activité électrique avec une bonne corrélation spatio-temporelle sur des cellules primaires de rats dissociées (neurones hippocampe).

    https://youtu.be/AUvPfs9jCBo
    Nom : Hippo.jpg
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  6. #4
    ThM55

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    C'est sûrement très intéressant, mais mon incompétence totale dans ce domaine m'empêche sans doute d'apprécier ceci à sa juste valeur. Je dois même avouer que je n'y comprends que dalle.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #5
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Je suis moi-même très incompétent... c'est juste que certains neurones "émettent" des signaux et qu'on les mesure...
    FinalSpark, Building a thinking machine.

  9. #6
    vyrac

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    donc de ce que j'ai compris vous avez développer des neurones de rat hors d'un rat et il "fonctionne" ,comme si a partir de cellules souche tu crée un bout de cerveaux?
    tu pense que cela serait possible de crée un véritable cerveau de rat vraiment fonctionnelle ?

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  11. #7
    vyrac

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    donc de ce que j'ai compris vous avez développer des neurones de rat hors d'un rat et il "fonctionne" ,comme si a partir de cellules souche tu crée un bout de cerveaux?
    tu pense que cela serait possible de crée un véritable cerveau de rat vraiment fonctionnelle ? ,et de jsp comment le transplanter dans un rat , offrir un corps au cerveau en gros.
    dit comme ça c'est pas éthique mais si c'est fait sans souffrance et que ça aide la rechercher ça pourrait être bien.

    " la je m'éloigne du sujet "
    De plus j'ai découvert que la modification génétique et pas si compliqué "bon c'est pas accessible a tous mais pour un biologiste c'est possible.
    donc on pourrait imaginer une expérience qui consister a crée plusieurs cerveau modifié a partir de la mémé souche que l'on transplanterais dans le même corps mais chacun leur tour afin de tester l’intelligence a partir d'un même outil "ici l'outil c'est le corps du rat on garde a chaque fois le même pour un teste égale', a terme on pourrais sélectionnent le meilleur puis le dupliqué et modifier ''une sélection des meilleur pour crée de mieux en mieux''un cerveau bcp plus performant.

    ce que je dit peut paraître stupide car c'est de la pur imagination mélanger a un très léger savoir et bcp de science-fi.
    merci d'avoir pris de ton temps pour lire ce message.

  12. #8
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Citation Envoyé par vyrac Voir le message
    donc de ce que j'ai compris vous avez développer des neurones de rat hors d'un rat et il "fonctionne" ,comme si a partir de cellules souche tu crée un bout de cerveaux?
    Oui, c'est exactement cela. A savoir que la dernière vidéo que j'ai postée a été réalisée avec des cellules "primaires", donc pas des cellules souches mais des cellules directement prélevées sur un rat avant d'être dissociées puis reconstituées en réseau.

    Citation Envoyé par vyrac Voir le message
    tu pense que cela serait possible de crée un véritable cerveau de rat vraiment fonctionnelle ?
    Anatomiquement, dans le principe oui, mais pas fonctionnel. Je ne travaille pas là-dessus. Pour faire ce que tu dis, il faut utiliser la technologie des organoides, qui permet de réaliser des mini cerveaux (et n'importe quel morceau d'organe) à partir de cellules souches. C'est particulièrement intéressant avec des organoides humais, pour faire des essais.

    Citation Envoyé par vyrac Voir le message
    " la je m'éloigne du sujet "
    De plus j'ai découvert que la modification génétique et pas si compliqué "bon c'est pas accessible a tous mais pour un biologiste c'est possible.
    donc on pourrait imaginer une expérience qui consister a crée plusieurs cerveau modifié a partir de la mémé souche que l'on transplanterais dans le même corps mais chacun leur tour afin de tester l’intelligence a partir d'un même outil "ici l'outil c'est le corps du rat on garde a chaque fois le même pour un teste égale', a terme on pourrais sélectionnent le meilleur puis le dupliqué et modifier ''une sélection des meilleur pour crée de mieux en mieux''un cerveau bcp plus performant.
    ce que je dit peut paraître stupide car c'est de la pur imagination mélanger a un très léger savoir et bcp de science-fi.
    merci d'avoir pris de ton temps pour lire ce message.
    Je n'ai aucune compétence en transplantation, mais cela me parait une méthode très compliquée...
    Il faut aussi se rendre compte que même à corps identique, les stimulus reçus par chacun de tes cerveaux seront différents, donc le test n'est pas égal.
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  13. #9
    vyrac

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    je trouve super sympa d'avoir pris de ton temps pour m'expliquer ton travail a l'air super intéressant je vais faire des recherche sur les micro .. j'ai oublier le nom mais pour la création d'organe je trouve que ça a un intérêt énorme pour le future de la médecine.

  14. #10
    vyrac

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Peut tu me dire précisément ce qu'est une cellule souche pour moi c'est une sorte de cellule qui a aucune fonction et qui peut devenir une cellule de n importe quelle type "mais elle peut se transformer une fois après elle reste comme ça".

  15. #11
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Citation Envoyé par vyrac Voir le message
    je trouve super sympa d'avoir pris de ton temps pour m'expliquer ton travail a l'air super intéressant je vais faire des recherche sur les micro .. j'ai oublier le nom mais pour la création d'organe je trouve que ça a un intérêt énorme pour le future de la médecine.
    Oui, c'est en effet extraordinaire. Maintenant on peut tester un médicament sur un organe fait à partir de tes propres cellules souches et aussi vérifier les effets secondaires sur tous tes autres organes importants (on peut recréer les cellules souches de quelqu'un à partir de cellules de sa peau, ce sont les IPSC qui nous permettent aussi faire des experiences avec des neurones humains... sinon ce serait assez compliqué à se procurer).

    Citation Envoyé par vyrac Voir le message
    Peut tu me dire précisément ce qu'est une cellule souche pour moi c'est une sorte de cellule qui a aucune fonction et qui peut devenir une cellule de n importe quelle type "mais elle peut se transformer une fois après elle reste comme ça".
    Non, je ne peux pas te dire précisément, je ne pense même pas que j'aurai l'audace de l'expliquer plus précisément que ce que tu as déjà très bien fait
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  16. #12
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Hello,

    Pour ceux que cela intéresse, nous avons mis online les activités électriques temps-réel (1 update par seconde) de neurosphères de neurones humains (IPSC) de notre labo, disponibles 24/7. Nous avons également ajouté l'image (1 update par heure).
    https://bioserver.net/live/

    Toutes questions, commentaires, suggestions bienvenus!

    Nom : lastcapture.jpg
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    Dernière modification par FinalSpark ; 20/05/2020 à 17h19.
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  18. #13
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Une image étonnante de ma culture de neurosphères humaines que j'ai obtenue aujourd'hui à l'occasion d'un contrôle de routine lors d'un changement de milieu...

    Nom : NSNice.jpg
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  19. #14
    Flyingbike
    Modérateur

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    wah ! super image
    La vie trouve toujours un chemin

  20. #15
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones de rats

    Oui, et ce qui est fou c’est qu’elle est sans aucun traitement, directement brute du microscope... sans doute un effet de polarisation entre le plastique des puits de culture et des gouttelettes de condensation (les puits de culture viennent d’un incubateur à 37C).
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  21. #16
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Bon, on a maintenant 4 réseaux d’électrode sous perfusion et monitoring 24/7, soit 16 neurosphères. Les boutons du site permettent de passer d’une MEA à l’autre pour voir la dernière photo (1 par heure) et les signaux (stream temps réel de notre labo).

    Nom : 0136ACD0-7538-493D-AF20-5F708987DDAA.jpg
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  22. #17
    IVame

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Bonjour !

    J'ai vus que tu proposais de répondre aux questions et les CS me fascine justement alors je me lance (je te préviens tout de suite je suis à un niveau d'étude très faible hihi) (Bac +1 covid)

    Les CS neuronales que tu utilises ont été obtenues par dédifférenciation à partir de cellules différenciés ? Comment est ce qu'on fait pour dédifférencier une cellule ?
    Qu'est ce que tu as fais comme cursus pour faire de la recherche sur cs ?

    Bonne journée !

  23. #18
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par IVame Voir le message
    Bonjour !

    J'ai vus que tu proposais de répondre aux questions et les CS me fascine justement alors je me lance (je te préviens tout de suite je suis à un niveau d'étude très faible hihi) (Bac +1 covid)

    Les CS neuronales que tu utilises ont été obtenues par dédifférenciation à partir de cellules différenciés ? Comment est ce qu'on fait pour dédifférencier une cellule ?
    Qu'est ce que tu as fais comme cursus pour faire de la recherche sur cs ?

    Bonne journée !
    Je suis désolé vraiment mais je sais juste que Yamanaka a eu le prix nobel en 2010 pour avoir trouvé comment regénérer les cellules souches, (et bien sûr c’est évidemment formidable pour la recherche!), mais je n’ai pas regardé en détail.

    Je suis physicien de formation avec un doctorat en traitement du signal, donc rien à voir avec les cellules souches
    FinalSpark, Building a thinking machine.

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  25. #19
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    On a battu cette nuit notre propre record de durée de vie d'une neurosphère sur électrodes: 50 jours!

    Malheureusement, par pure coincidence, cette nuit vers 2 heures du matin, un probléme sur une pompe péristaltique a finalement eu raison d'elle...
    voici certaines des dernières données que nous avons.
    NS.jpg
    Images attachées Images attachées  
    Dernière modification par FinalSpark ; 21/04/2021 à 09h49.
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  26. #20
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    La neurosphére la plus active est située à droite.
    Nom : NS.jpg
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Taille : 145,1 Ko
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  27. #21
    GBo

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Bonjour FinalSpark, peux tu réexpliquer ce qu'est une neurosphère s'il te plait ?
    Mon background est math/info, je connais le neurone formel:

    (à noter que les poids ne sont pas figurés mais ce sont les coefficients w appliqués à chaque entrée avant la sommation).


    ...qui a été inspiré de ceci:


    Les dendrites constituent les entrées et servent à accumuler de la charge électrique au niveau du neurone jusqu’à atteindre un certain seuil. C’est alors que le neurone transmet un signal via l’axone qui agit comme sortie du neurone.
    L’expérience montre de plus que les dendrites ne sont pas toutes équivalentes, certaines contribuent plus fortement que d’autre à atteindre le seuil, on associe donc les dendrites à un poids.
    Soure: https://amethyste16.wordpress.com/20...b%2FRosenBlatt.
    Dernière modification par GBo ; 22/05/2021 à 11h31.

  28. #22
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par GBo Voir le message
    Bonjour FinalSpark, peux tu réexpliquer ce qu'est une neurosphère s'il te plait ?
    Mon background est math/info, je connais le neurone formel:

    (à noter que les poids ne sont pas figurés mais ce sont les coefficients w appliqués à chaque entrée avant la sommation).


    ...qui a été inspiré de ceci:



    Soure: https://amethyste16.wordpress.com/20...b%2FRosenBlatt.
    Une neurosphère est "juste" un agglomérat de neurones. On pense qu'elle contient entre 100'000 et 1millions de neurones pour un diamètre allant de 300 à 1000 um, j'en ai actuellement une cinquantaine. On la pose sur des électrodes qui servent à lire et stimuler. Par contre le modèle mathématique réaliste est très complexe (d'autres comme Pr. Markram travaillent dessus) et pour notre part on ne cherche pas à le modéliser mais juste à l'utiliser.

    Tu peux voir sur la video ci-dessous les signaux que nous avons enregistré, qui montrent leur complexité:
    https://www.youtube.com/watch?v=AUvPfs9jCBo&t=36s


    Citation Envoyé par GBo Voir le message
    Super intéressant FinalSpark, mais pourquoi prendre des cellules souches humaines et non pas de rat, quelle différence fonctionnelle au niveau élémentaire ? (je ne parle pas du cerveau fini, ayant déjà essayé de discuter avec un gros rat, je connais la réponse :- ) ?
    Je ne connais pas les différences fonctionnelles au niveau élémentaires entre les neurones de rat et humain. Ils ont une morphologie différente.

    En fait, on cultive les deux. Le problème des humaines et que leur maturation (le temps qu'ils mettent à devenir électriquement actifs) est plus lente, par contre tant qu'à faire, puisque le but est de reproduire des fonctions cognitives on est plus tenté d'utiliser les humaines.

    Certains mélangent des neurones de rat et d'humain, c'est une direction intéressante. Il y a encore très peu de travaux sur la plasticité neuronale (i.e. modifier leur comportement) in vitro de neurones humains par stimulation électrique.
    FinalSpark, Building a thinking machine.

  29. #23
    GBo

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    D'accord, je croyais qu'il fallait connecter chaque synapse/axone, il y avait un problème d'échelle
    Là c'est plutôt comme un électroencéphalogramme que l'on voit sur la vidéo, c'est ça ? mais du coup comment contrôler les entrées/sorties si ce n'est pas au niveau le plus fin ?

  30. #24
    GBo

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Autres questions, à ce stade que je présume immature de connexion neuro, la "connectique" s'est-elle déjà différentiée qui en cortex visuel, qui en zone du langage (etc...) Et si non, est-ce pertinent de vouloir en attendre une quelconque capacité de traitement ?

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  32. #25
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par GBo Voir le message
    D'accord, je croyais qu'il fallait connecter chaque synapse/axone, il y avait un problème d'échelle
    Là c'est plutôt comme un électroencéphalogramme que l'on voit sur la vidéo, c'est ça ? mais du coup comment contrôler les entrées/sorties si ce n'est pas au niveau le plus fin ?
    Bah, en général une électrode mesure les impulsions d’un seul neurone. Donc on ne sait pas à l’avance sur quoi on va tomber quand on place la neurosphere, mais ensuite c’est bon: on mesure à une fréquence d’échantillonage de 30khz les spikes entre 30 et 200 uV, et on stimule quand on veut donc c’est assez fin.

    Citation Envoyé par GBo Voir le message
    Autres questions, à ce stade que je présume immature de connexion neuro, la "connectique" s'est-elle déjà différentiée qui en cortex visuel, qui en zone du langage (etc...) Et si non, est-ce pertinent de vouloir en attendre une quelconque capacité de traitement ?
    Alors, non, cela nous est totalement inaccessible avec une simple neurosphère, pour cela il faudrait au moins utiliser des organoides, plus proche d’un mini cerveau.

    En ce qui concerne la capacité de traitement, toute l’idée consiste à entrainer une neurosphère à faire une tache précise. Par exemple, tu lui envoie une image via 64 électrodes (point blanc = 1 impulsion), et tu releve sa réponse sur une électrode (on en est pas encore là!).
    FinalSpark, Building a thinking machine.

  33. #26
    Archi3

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Hello
    j'essaie de comprendre ce que vous faites ... vous cultivez donc des neurones qui se différencient à partir de cellules souches, qui font des gros tas de cellules connectées "un peu au hasard" , et ensuite vous les utilisez en mesurant la réponse d'une excitation électrique , ce qui vous donne une sorte "d'empreinte digitale" caractéristique de votre sphère , que vous utilisez ensuite comme "détecteur" de la structure d'entrée c'est ça ?

    mais je suppose que pour que ce soit interessant, il faut que votre sphère fasse un traitement du signal qui lui permettre d'extraire des informations différentes et par certains cotés plus synthétiques que l'information de départ, du genre que vous repériez un signal caractéristique de 'la présence d'un cercle dans une image" , c'est ça ?
    Le plus dur n'est pas de piger les raisonnements compliqués, mais d'accepter les simples.

  34. #27
    GBo

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par FinalSpark Voir le message
    Bah, en général une électrode mesure les impulsions d’un seul neurone. Donc on ne sait pas à l’avance sur quoi on va tomber quand on place la neurosphere, mais ensuite c’est bon: on mesure à une fréquence d’échantillonage de 30khz les spikes entre 30 et 200 uV, et on stimule quand on veut donc c’est assez fin.
    Ce que je ne vois pas, c'est combien il y a d'électrodes sous la surface d'une neurosphère
    Si je prends cette capture d'écran de ta vidéo, il y a une trentaine de pixels allumés sous la 2ieme sphère.

    Nom : FSCapture.PNG
Affichages : 190
Taille : 80,0 Ko

    Le pixel est d'autant plus chaud (rouge) qu'il y a de neurones activés à ce moment là, c'est ça ?
    Ca doit en faire un paquet par pixel non ?

    Merci
    Dernière modification par GBo ; 22/05/2021 à 18h26.

  35. #28
    mh34
    Responsable des forums

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par FinalSpark Voir le message
    Je l’ignore.

    Je n’ai jamais lu que les cellules que l’on utilise aient quoi que ce soit de spécifique au niveau génétique, mais ce n’est pas ma spécialité.

    On utilise des progéniteurs neuronaux, ce sont des cellules souches qui sont déjà programmées pour devenir des neurones, ce qui compte au premier ordre ne sont pas les mutations, mais en quel type de neurones ils vont se différencier (il y a plein de types de neurones!)
    Je continue donc ce point ici.
    On sait que le processus permettant d'obtenir des IPS peut provoquer des mutations ( voir le dossier de l'Inserm sur le sujet, ici ; https://www.inserm.fr/information-en...s-induites-ips).
    Par exemple si la mutation intervient sur LMNB1...vu le rôle de ce gène...le retentissement va être considérable sur le neurone qui va en résulter et donc sur sa fonction.
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28687747/
    Ma question était juste de savoir si vous preniez cet élément en compte ou pas.

  36. #29
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par GBo Voir le message
    Ce que je ne vois pas, c'est combien il y a d'électrodes sous la surface d'une neurosphère
    Si je prends cette capture d'écran de ta vidéo, il y a une trentaine de pixels allumés sous la 2ieme sphère.

    Pièce jointe 439986

    Le pixel est d'autant plus chaud (rouge) qu'il y a de neurones activés à ce moment là, c'est ça ?
    Ca doit en faire un paquet par pixel non ?

    Merci


    Ici c’est un circuit CMOS haute densité, tu as une électrode par pixel donc plus d’une centaine pour la neurosphere.
    Attention, la couleur ne donne pas le nombre de neurones sur cette électrode mais seulement le voltage. Considère qu’en général chaque électrode mesure au maximum 1 seul neurone.
    FinalSpark, Building a thinking machine.

  37. #30
    FinalSpark

    Re : Mise en culture de cellules souches de neurones

    Citation Envoyé par mh34 Voir le message
    Je continue donc ce point ici.
    On sait que le processus permettant d'obtenir des IPS peut provoquer des mutations ( voir le dossier de l'Inserm sur le sujet, ici ; https://www.inserm.fr/information-en...s-induites-ips).
    Par exemple si la mutation intervient sur LMNB1...vu le rôle de ce gène...le retentissement va être considérable sur le neurone qui va en résulter et donc sur sa fonction.
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28687747/
    Ma question était juste de savoir si vous preniez cet élément en compte ou pas.
    Ah Ok, non on ne le prend pas en compte... et surtout je l’ignorais! Par contre, je n’ai jamais lu de publications en electrophysiologie où les gens s’en inquiétaient.
    FinalSpark, Building a thinking machine.

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