enzymes de restriction

[Juliette16]

Bonjour

1 ) Les enzymes de restriction permettent d'obtenir soit des extrémités franches, 5' sortantes ou 3' sortantes.

Dans un exo, après avoir classé les différents types d'enzymes , nous devons indiquer les enzymes dont les extrémités sont compatibles entre elles.

On a vu que SMAI CCC-GGG et PVUII CTG-CAG étaient compatibles entre elles . ( ce sont des enzymes permettant d'obtenir des enzymes à extrémités franches , "-' indique la coupure )
Mais je ne comprends pas pourquoi ... Est-ce que toutes les enzymes à extrémités franches sont compatibles entre elles ?

les extrémités des enzymes 5' sortantes sont compatibles uniquement avec des extrémités 5' sortantes ?
les extrémités des enzymes 3' sortantes sont compatibles uniquement avec des extrémités 3' sortantes ?

je prends par exemple deux enzymes 5' sortantes : Pour savoir si leurs extrémités sont compatibles , je regarde si les enzymes coupent au même endroit et s'il y a des nucléotides en commun

Cla I :AT-CGAT et SFU I : TT-CGAA
ici, lenzyme CLA I coupe après 2nucléotides et SFU coupe après deux nucléotides également .
Il ya CG en commun .
= Elles sont compatibles .

2 molécules d' ADN peuvent se ré assembler si leurs bases sont complémentaires( grâce à l'ADN ligase )

[U]autre exemple : SPE I :A-CTAGT et NHE I :G-CTAG C
Je remarque tout de suite que les enzymes de restriction SPE I et NHE I coupent le brin d'ADN après 1 nucléotide . Et, on a 4 nucléotides en commun
: je peux affirmer que ces deux enzymes de restriction permettent d'obtenir des extrémités dont les bases sont compatibles .

ADN 1 ( coupé par SPEI) et ADN 2 ( coupé par NHE) vont s'associer pour former :

5' ACTAGC 3'
3' TGATCG 5'

Bon je pense avoir compris mais je sais pas si c'est très clair dans ma tête ...


2 ) l' ADN du plasmide est circulaire ( PBR 322) et comprend 4363pb.Il est soumis à l'action d'endonucléases de restriction ( ECORI, SMA I , CLA I , BAMHI ...)dans des conditions oùl'hydrolyse est totale.Les produits de digestion enzymatiques sont soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose.
Le profil de digestion par ces enzymes aurait-il été le même si la molécule de PBR 322 avait été linéaire ?

Quand l' ADN est linéaire, il y a une relation linéaire entre la vitesse de migration et la taille des fragments d' ADN .

exemple : CLA I : AT-CGAT et PST I : CTGCA-G

les + petits fragments migrent + loin que les gros fragments . Cela signfie que CTGCA migrera moins loin que AT ou CGAT ?

je n'ai pas trop compris la fréquence des sites de restriction ... une enzyme est susceptible de couper tous les 4kPB ?


3) vous disposez de fragments d' ADN qui ont été produits par l'action de différentes enzymes de restriction.Vous souhaitez les insérer dans le vecteur PZT dont le site multiple de clonage est donné ci dessous :

---SMAI--------ECORI-----------PVUII----------BMTL----------SPel

1. Quels sites de restriction du site multiple de clonage utiliserez-vous si vous fragments d'ADN ont des extrémités :

- franches
- ECORI
- NHEL
- NHEL et ECORI ?
Comment procédez-vous ?


je ne comprends pas trop là
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[Taz_79]

Salut,

Pour les questions 2 et 3 je penses pouvoir t'éclairer un peu.

Le profil de digestion par ces enzymes aurait-il été le même si la molécule de PBR 322 avait été linéaire ?

Les enzymes de restrictions que tu utilises sont des endonucléases qui ne clivent donc qu'à l'intérieur d'un brin d'ADN. Pour cela il faut suffisamment de matériel autour de l'enzyme pour qu'elle clive sur son site de restriction d'où les plasmides circularisés. Donc si ton plasmide est linéarisé et que ton site de restriction se trouve aux extrémités de ton plasmide linéarisé alors ton enzyme de restriction ne pourra pas agir car elle n'a pas suffisamment de matériel autour d'elle. Du coup ton profil de digestion risque d'être différent par rapport à celui du plasmide circularisé.

je n'ai pas trop compris la fréquence des sites de restriction ... une enzyme est susceptible de couper tous les 4kPB ?

La fréquence est liée au nombre de site de l'enzyme de restriction que tu vas retrouver dans ton plasmide ou dans ton génome par exemple. C'est- à-dire que si tu as ce que l'on appelle une enzyme de restriction à haute fréquence, c'est que son site de restriction se retrouve très souvent dans le génome et du coup elle va être capable de couper très souvent et tu obtiendras plein de petit fragments. A contrario tu as les enzymes de basse fréquence qui ont très peu de site sur le génome et dans ce cas là tu obtiendras de plus gros fragments.
Un petit lien qui pourra t'aider : http://www.edu.upmc.fr/sdv/masselot_...mentation.html

vous disposez de fragments d' ADN qui ont été produits par l'action de différentes enzymes de restriction.Vous souhaitez les insérer dans le vecteur PZT dont le site multiple de clonage est donné ci dessous :

---SMAI--------ECORI-----------PVUII----------BMTL----------SPel

1. Quels sites de restriction du site multiple de clonage utiliserez-vous si vous fragments d'ADN ont des extrémités :

Ici on te dit que ton ADN a été clivé par différentes enzymes de restriction donc après clivage selon les enzymes de restriction utilisées, tu va avoir des ADN avec des bouts francs ou bien des ADN avec des extrémités cohésives. Maintenant quand on veut cloner dans un plasmide celui-ci est digéré par une enzyme de restriction ne possédant qu'un seul site sur le plasmide et créant ainsi des extrémités cohésives au niveau du site de coupure. Donc pour cloner ton ADN au niveau de la coupure du plasmide il faut que les extrémités de ton ADN soient complémentaires avec les extrémités de ton plasmide précédemment clivé. Voici grossomodo le principe qui je pense t'aideras pour cette question.

Si c'est pas très claire je tenterais de te réexpliquer.
Bonne soirée

[Juliette16]

salut, merci pour ton aide !


3 )

Si on coupe le plasmide par SPE 1 au niveau de la séquence ACTAGT , on obtient des extrémités 5' protubérantes 5' A-CTAGT 3' et 3' TGATC-A 5' qui sont compatibles avec le fragment d' ADN ayant des extrémités NHE1


PVuII et SmaI sont deux sites du plasmide qui permettent d'obtenir des extrémités franches
mais, si j'ai un fragment d'ADN avec une extrémité franche , il ne pourrait pas forcément s'insérer au niveau du site PVUII et Sma I ?
SMA I : 5' CCC-GGG 3 ' et PVUII : 5' CTG-CAG 3'

Si mon extrémité franche d'ADN est par ex : 5' AGC-CTT 3 ' elle ne va pas pouvoir s'associer ? ? :/
---------------------------------------------------------


sinon, j'avais noté que les séquences coupées par BAm HI et BGI II

5' G-GAtCC 3' 5' A-GATCT 3'
3' CCTAG-G 5' et 3' TCTAG-A 5' pouvaient se réassocier en

5' GGATCT 3 '

3'CCTAGA 5'

, mais elles peuvent aussi se réassocier en 5' AGATCC 3 ' non ?
3'TCTAGG 5'
l

es "-" indique les sites de coupures




merci beaucoup
bon weekend

[Juliette16]

salut, merci pour ton aide !


3 )

Si on coupe le plasmide par SPE 1 au niveau de la séquence ACTAGT , on obtient des extrémités 5' protubérantes 5' A-CTAGT 3' et 3' TGATC-A 5' qui sont compatibles avec le fragment d' ADN ayant des extrémités NHE1


PVuII et SmaI sont deux sites du plasmide qui permettent d'obtenir des extrémités franches
mais, si j'ai un fragment d'ADN avec une extrémité franche , il ne pourrait pas forcément s'insérer au niveau du site PVUII et Sma I ?
SMA I : 5' CCC-GGG 3 ' et PVUII : 5' CTG-CAG 3'

Si mon extrémité franche d'ADN est par ex : 5' AGC-CTT 3 ' elle ne va pas pouvoir s'associer ? ? :/
---------------------------------------------------------


sinon, j'avais noté que les séquences coupées par BAm HI et BGI II

5' G-GAtCC 3' 5' A-GATCT 3'
3' CCTAG-G 5' et 3' TCTAG-A 5' pouvaient se réassocier en 5' GGATCT 3 '
3'CCTAGA 5'
, mais elles peuvent aussi se réassocier en 5' AGATCC 3 ' non ?
3'TCTAGG 5'
le "-" indique les sites de coupures




merci beaucoup
bon weekend

[A voir en vidéo sur Futura]

[Samira-92947]

Bonjour, svp j'ai un exercice et je souhaite que vous avez la reponse ! voici le lien " exercice 4 ":
https://perso.univ-rennes1.fr/stepha.../td_5_et_6.htm

[Flyingbike]

Bonjour

Lisez ça : A lire avant de demander de l'aide pour un exercice


et revenez nous voir